72º CONGRESO ARGENTINO DE BIOQUÍMICA

Afrontando el Constante Desafío de la Bioquímica

22 al 25 de agosto de 2017

HEMOGLOBINURIA PAROXISTICA NOCTURNA

Fisiopatología y diagnóstico del laboratorio

en la hemólisis intravascular

Dra. Mónica T F Aixalá

HEMORRAGIAS HEMOLISIS

REGENERATIVA

destrucción o pérdida excesiva de eritrocitos

ANEMIA

AGUDAS CRONICAS EXTRACORPUSCULAR

adquiridas

INTRACORPUSCULAR

hereditarias

Anticuerpos

Drogas

Hemoparásitos

Quemaduras

Sustancias físicas

Sustancias químicas

Válvulas cardíacas

Enzimopatías

Hemoglobinopatías

Membranopatías

Adquirida

Intracorpuscular

HPN

INTRODUCCION

HEMOGLOBINURIA PAROXISTICA NOCTURNA (HPN)

SINDROME DE MARCHIAFAVA MICHELI

Ettore Marchiafava (1847-1935)

Ferdinando Micheli (1872-1937)

Descripta inicialmente por William Gull (1866)

(1816-1890)

y con precisas observaciones clínicas por Paul Strϋbing (1882)

Góngora-Biachi R et al: Rev Biomed,1999

STEM CELL

PLURIPOTENTE

STEM CELL

LINFOIDE

STEM CELL

MIELOIDE

TIMO

LINFOCITO T

LINFOCITO NK

LINFOCITO B CELULA

PLASMATICA

ERITROCITO

MEGACARIOCITO

MONOCITO

MACROFAGO

GRANULOCITO

Luzzatto L et al: Int J Hematol, 2006

Hernández-Campo P et al: Med Clin (Barc), 2008

GEN

GPI “ANCLA”

CORE GLICANO

FOSFATIDIL INOSITOL

FOSFO

ETANOL

AMINA

PROTEINA

Anclada al GPI Transmembrana

Citoplasma

Espacio

extracelular

GEN

GPI “ANCLA”

CORE GLICANO

FOSFATIDIL INOSITOL

FOSFO

ETANOL

AMINA

PROTEINA

Anclada al GPI Transmembrana

Citoplasma

Espacio

extracelular

Glicosil fosfatidil inositol

MEMBRANA

ETANOLAMINA

PROTEÍNA

CORE GLICANO

FOSFATIDIL

INOSITOL

Bessler M et al: Hematology, 2008

PROTEINAS UNIDAS AL GPI

(deficientes en HPN)

Las proteínas unidas al GPI tienen múltiples funciones:

Enzimas: acetil colinesterasa

fosfatasa alcalina

Receptores/inmunológicas: receptor uroquinasa (UPAR),

receptor FCIII (CD16), antígeno 3 de función linfocitaria (LFA-3) (CD58),

receptor de polisacáridos bacterianos (CD14)

Reguladores del complemento: CD55 (DAF, factor acelerador de la degradación)

CD59 (ILRM; factor inhibidor de la lisis reactiva de membrana)

FHR (factor homólogo de restricción)

Adhesión molecular: Campath-1(CDw52)

PROTEINAS UNIDAS AL GPI

(deficientes en HPN)

Bessler M et al: Hematology, 2008

CELULAS HPN

FENOTIPO

Diferentes células HPN (I, II, III)

Depende del porcentaje presente de las diferentes proteínas unidas al GPI

Diferente sensibilidad al complemento

Anemia hemolítica intravascular mediada por

complemento

Fallo en la médula ósea

Trombosis

DEFICIENCIA DE PROTEINAS

Y MANIFESTACIONES CLINICAS

• disfagia, letargia,

• disfunción eréctil, fallo renal,

• hipertensión pulmonar, hemoglobinuria

Anemia hemolítica intravascular mediada por complemento

• Hepática porta(síndrome de Budd Chiari)

• Esplénica

• Mesentérica

Trombosis

(venas)

• en algun grado: ocurre en todos los paciente

• en las formas más extremas de

presentación: anemia aplásica severa

Fallo en

la médula ósea

HEMOLISIS INTRAVASCULAR

MEDIADA POR COMPLEMENTO

Hemólisis intravascular (hemoglobina libre)

Importantes secuelas clínicas

HPN

Anemia

Fatiga

Trombosis Tromboembolismo (mayor causa

de morbilidad y muerte)

proteínas reguladoras del complemento

Relación con tamaño del clon,

Intensidad de hemólisis,

activación y agregación de plaquetas

Hillmen P et al: Blood, 2007

Yenerel M et al: Blood Cells Mol Dis, 2017

SISTEMA COMPLEMENTO

• Componente clave de la inmunidad innata

• En fase fluida y participan diferentes proteínas

• Tres vías de activación: clásica, alterna, lectinas

• Todas terminan en un mecanismo efector común: complejo de ataque a la membrana (MAC)

Risitano A: Immunobiology, 2012

Macías Pérez I et al: Rev Cub Hematol, Inmunol, Hemot, 2013

CD55

CD55: factor acelerador de la degradación (DAF) Primer regulador del complemento que se detectó disminuido/ausente

en células NPH

Función:

Controla la activación del complemento en la superficie celular

Inhibe la formación y estabilidad de la C3 convertasa (para desactivar a la moléculas)

Protege a las células del ataque del complemento

Consecuencia de su defecto:

Mayor fijación del complemento por las células y hemólisis

intravascular Risitano A: Immunobiology, 2012

Macías Pérez I et al: Rev Cub Hematol, Inmunol, Hemot, 2013

Presente en todas las líneas celulares hematopoyéticas

Presente en todas las líneas celulares hematopoyéticas

Función:

Interviene en la fase final de la cascada del complemento

Bloquea la incorporación del C9 al complejo C5b-C8,

lo que previene el ensamble entre la membrana y

el complejo de ataque (MAC)

Regula y protege de la lisis celular

Consecuencia de su defecto:

Hemólisis intravascular

CD59

CD59: inhhibidor de la lisis reactiva de membrana (MIRL)

Risitano A: Immunobiology, 2012

Macías Pérez I et al: Rev Cub Hematol, Inmunol, Hemot, 2013

VIAS DE ACTIVACION DEL COMPLEMENTO

Bessler M et al: Hematology, 2008

Rother R et al: JAMA, JAMA 2005

Misztal T et al: Postepy Hig Med Dosw, 2011

HEMOLISIS INTRAVASCULAR

Síntomas comunes en diferentes patologías

(anemia drepanocítica, HPN, hemólisis inducida por drogas):

hipertensión, hemoglobinuria, hipercoagulabilidad

Saturación de los mecanismos protectores fisiológicos

“scavenger”: hemoglobina libre,

con consecuente hemoglobinuria, con posible daño renal

biodisponibilidad del óxido nítrico

Rother R et al: JAMA, JAMA 2005

Misztal T et al: Postepy Hig Med Dosw, 2011

HEMOLISIS INTRAVASCULAR

alteración del tono muscular vascular isquemia,

hiperreactividad plaquetaria,

hipertensión pulmonar, tromboembolismo,

alteración de expresión de

moléculas de adhesión

hemoglobina libre

Misztal T et al: Postepy Hig Med Dosw, 2011

HEMOLISIS INTRAVASCULAR

Efectos citotóxicos, prooxidantes y proinflamatorios

hemoglobina libre/HEMO

La HbL promueve la acumulación de radicales hidroxilo,

vía la reacción de Fenton, lo que resulta en

un daño tisular oxidativo

HEMOLISIS INTRAVASCULAR

Fe HEMO

biodisponibilidad

NO

disfunción

endotelio

vascular

Kato G et al: Blood Reviews, 2007

Fallo de médula ósea Expansión clonal de células HPN

(células deficientes en ciertas proteínas)

Alteración de la actividad

del complemento

Hemólisis extravascular

Colelitiasis Pancitopenia

Hemólisis intravascular

Hemoglobinuria

Anemia

Infecciones

Sangrado

Trombosis

Fallo renal

Dolor abdominal

Dolor de cabeza

Disfunción eréctil

Fatiga

Bessler M et al: Hematology, 2008

Pruebas Bioquímicas

y Hematológicas

Hemograma

Reticulocitos

Metabolismo del Fe

Parámetros de hemólisis:

sangre y

orina

Pruebas diagnósticas

HPN NORMALES p

Hematíes

1012/L 3,0 ± 0,7 4,7+0,3 < 0,01

Hb g/dL 8,8 ± 2,2 14,6 ± 0,9 < 0,01

Leucocitos 109/L 4,6 ± 2,1 6,3 ± 1,4 < 0,01

Plaquetas 109/L 208 ± 240 245 ± 55 < 0,01

HEMATIMETRIA

Canalejo K et al: Int J Lab Hematol, 2014

Plaquetas: media normal

Rango amplio:

60 % (disminuidas)

10 % (aumentadas)

Macrocitosis

Policromatofilia

Aumento de reticulocitos

Aumento de fracción inmadura (V.N.: 0,26+0,07)

MORFOLOGIA ERITROCITARIA

MORFOLOGIA ERITROCITARIA

10 %

50 %

5 %

25 %

20 %

15 %

MORFOLOGIA ERITROCITARIA

Canalejo K et al: Int J Lab Hematol, 2014

MORFOLOGIA ERITROCITARIA

Microcitosis e hipocromía: ¿descenso de hierro?

Esquistocitos: ¿trombosis?

Dacriocitos: ¿daño medular?

ADE: heterogeneidad del tamaño celular

MetaHb

HEM

Metahemalbúmina

Hemopexina-Hem

HpHb

HEMOLISIS INTRAVASCULAR

Dímeros

+ Hp

Globinas

+ Hx

+ Albúmina + Hx

HEMOGLOBINA

Hb

Hb libre

Hemoglobinuria

Hemosiderinuria

Urobilina

Hemoglobinuria

Hemosiderinuria

PARAMETROS DE HEMOLISIS

Plasma

castaño dorado

Bilirrubina Indirecta

Haptoglobina

LDH

Isoenzimas 1 y 2

Parámetro % de pacientes

LDH 100

Reticulocitos 100

Haptoglobina 95

Hierro N 95

FAL 95

Hb 95

ADE 75

Bilirrubina I 70

Neutrófilos 63

Plaquetas 60

VCM>100fL 45

LDH 1984+1184 UI/L

Reticulocitos 210+147x109/L

PARAMETROS DE LABORATORIO

Canalejo K et al: Int J Lab Hematol, 2014

Aumento de reticulocitos y LDH: confirman

el estado hemolítico. Son la consecuencia de la susceptibilidad incrementada

de los eritrocitos a la lisis por complemento

LDH: parámetro de hemólisis,

asociado con el HEMO libre,

el metabolismo del óxido nítrico

y el estrés oxidativo.

La actividad de la LDH es la elegida

para monitorear la respuesta a la terapia

con Eculizumab

LDH

LDH ( 1,5 veces valor superior normal)

riesgo trombótico y mortalidad

Pacientes con LDH 1,5 veces valor superior

normal: probabilidad de mortalidad 4,8 veces

más comparado con la población general

(en cuanto a edad y sexo)

LDH

Yenerel M et al: Blood Cells Mol Dis, 2017 Jang J t al: J Korena Md Sci, 2016

HAM/SUCROSA

Tubo prueba (reproducir in vitro la situación del paciente ante pH y activación del complemento)

Tubos controles para descartar “interferencias”

con otras situaciaones (AHA, EH,

incompatibilidad ABO, HEMPAS)

Descenso de la fuerza iónica:

activación del complemento

Mayor especifidad

AHA: anemia hemolítica autoinmune

EH: esferocitosis hereditaria

HEMPAS (ADCII):Hereditary Erythroblast Multinuclearity with Positive Acidified Serum test

HAM

SUCROSA

La más alta Hb del grupo

FAL aumentada

Bajo porcentaje de

expresión de células negativas

(CD55 y CD59 en eritrocitos) Sensibilidad del test de HAM

HAM Y SUCROSA positivos 18/20

HAM negativo y SUCROSA positivo 1/20

HAM positivo y SUCROSA negativo 1/20

HAM/SUCROSA

Canalejo K et al: Int J Lab Hematol, 2014

HAM/SUCROSA

Si están correctamente estandarizadas, con controles adecuados,

pueden ser útiles como screening

• Sólo se realizan sobre eritocitos

Las transfusiones, hemólisis intensas, tratamientos con corticoides pueden

interferir en los resultados

El resultado puede depender del tipo de células HPN predominantes en el paciente

(I, II, III)

Gupta R et al: Int J Lab Hematol, 2007

Krauss J: Ann Clin Lab Sci, 2003

FOSFATASA ALCALINA LEUCOCITARIA (FAL)

FAL Enzima hidrolítica perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas

Actividad en citoplasma de neutrófilos, osteoblastos, células endoteliales

vasculares, macrófagos

En gránulos secundarios de los neutrófilos

Técnica citoquímica: Kaplow

Otra metodología “en busca”

de proteínas unidas al GPI

en HPN

CITOMETRIA DE FLUJO (CF)

CF Marcación de diferentes proteínas

unidas al GPI

Mayor especificidad y sensibilidad

Permite la detección y cuantificación de las diferentes

poblaciones HPN

CONCLUSIONES

Desorden clonal, caracterizado por deficiencia de la GPI,

y de las proteínas unidas

(muchas relacionadas con la regulación del

sistema complemento)

Hemólisis intrravascular: hemoglobina libre determina

características clínicas y del laboratorio

LDH y reticulocitos son importantes para el diagnóstico,

pronóstico y seguimiento

Diferentes pruebas diagnósticas: Ham y Sucrosa (screening),

citometría de flujo (mayor sensibilidad y especificidad) y

fosfatasa alcalina leucocitaria (otra metodología)

MUCHAS GRACIAS