Agrobiotecnología. Curso 2011

Sistemas de transformación vegetal

Sistemas de transferencia genética en plantas

Transparencias 3-6

Antes de elegir un sistema de transformación vegetal, es importante establecer un protocolo de cultivo de tejidos y de regeneración de las plantas. Este protocolo es parte integral de la mayoría de las estrategias de transformación y es generalmente el aspecto más exigente de las mismas. La clave para integrar exitosamente las técnicas de cultivo de tejidos dentro en una estrategia de transformación es la obtención de un sistema de regeneración rápido y eficiente. No todos los protocolos de regeneración son compatibles con todas las técnicas de transformación. Mientras una gran variedad de estrategias de regeneración y transformación son aplicables a muchos cultivos, se requieren protocolos muy particulares y específicos para la modificación de determinadas especies. En términos generales, algunos protocolos son claramente más eficientes que otros. Por ejemplo, la regeneración de embriones maduros a partir de embriones somáticos es el método más adecuado para la regeneración de especies monocotiledóneas. Por lo tanto, establecer una buena estrategia de regeneración y cultivo de tejidos es primordial antes de implementar una técnica de transformación. La transparencia 4 muestra un diagrama de flujo orientativo para establecer un protocolo de transformación. Primero, hay que identificar el tejido o células de las que se puede regenerar una planta, establecer los agentes de selección apropiados, las hormonas requeridas, los medios de cultivos adecuados para desarrollar una regeneración eficiente de plantas enteras y fértiles (recuadro superior de la transparencia 4). Una vez establecidos estos parámetros hay que realizar las construcciones genéticas, y recién entonces determinar el sistema de más apropiado para la introducción del material genético y establecer los principales parámetros del procedimiento correspondiente (recuadro inferior).

La transformación de plantas se refiere al evento de introducir e integrar ADN foráneo en células vegetales y regenerar plantas transgénicas. La transparencia 6 enumera las diferentes técnicas de transformación de plantas que se han desarrollado con el objeto de hacer más fácil y eficiente esta metodología. Los sistemas de trasferencia pueden dividirse en dos grupos:

Sistemas basados en vectores biológicos:• Transferencia mediada por Agrobacterium• Transferencia basada en virus vegetales.

Sistemas de transferencia directa de ADN, sistemas basados en transferencia física, surgidos como alternativa para transformar especies monocotiledóneas que no son hospedantes naturales de Agrobacterium:

• Transferencia por bombardeo de partículas o biobalística.• Transferencia por cationes divalentes y/o electroporación.• Transferencia con whiskers de carburo de silicio.• Transferencia por microinyección.

Los métodos de transformación desarrollados permiten la expresión transitoria o la expresión estable del ADN introducido. La expresión transitoria ocurre durante un período corto de tiempo (pocos días) o hasta culminar el ciclo de vida de la planta,

pero no es heredable por la progenie. La expresión estable permite la integración del ADN foráneo al genoma vegetal y la consiguiente transmisión a las siguientes generaciones.

Biología de Agrobacterium tumefaciens

Transparencias 7-19

Pese al desarrollo de otros métodos para la transferencia de genes, el método más difundido es la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens es una bacteria del suelo gram negativa que ataca a un amplio rango de plantas dicotiledóneas. Muchas especies agronómicamente importantes han sido transformadas usando esta bacteria del suelo (micrografía de la transparencia 8) y la lista de especies susceptibles a la transformación por Agrobacterium se incrementa continuamente. La fotografía del panel inferior de la transparencia 8 muestra un tumor típico causado por A. tumefaciens, comúnmente denominado agalla del tallo. El género Agrobacterium ataca a un amplio rango de huéspedes, principalmente entre las especies dicotiledóneas. Con baja eficiencia puede infectar también a varias especies monocotiledóneas.

La transformación mediada por Agrobacterium puede lograrse utilizando explantos de tejido muy variados, los que deben seleccionarse de acuerdo con las características de la especie vegetal o de la variedad con la que se trabaje. En algunos casos (tabaco, papa), es posible utilizar tejidos muy diferentes con este fin. En otros casos, el explanto de elección es sumamente específico. La tabla de la transparencia 5 presenta ejemplos de los explantos más comúnmente utilizados.

El género Agrobacterium incluye varias especies patogénicas que presentan un amplio rango de huéspedes y de sintomatologías. La bacteria causa la formación de tumores en la zona cercana al sitio de infección. El desarrollo de estos tumores se debe a que Agrobacterium ha desarrollado la capacidad de transferir parte de su propio material genético a la planta hospedante. La transparencia 9 muestra el ciclo de la enfermedad de la agalla de corona causada por Agrobacterium tumefaciens. La formación de tumores ocurre generalmente en el tallo de la planta, inmediatamente sobre el nivel del suelo. La formación de estos tumores se debe a la transferencia de genes bacterianos que intervienen en la síntesis de fitohormonas. La bacteria transfiere también genes que participan de la síntesis de una serie de compuestos de conjugación denominados opinas, los que son secretados al medio y utilizados como fuente de carbono y nitrógeno en forma exclusiva frente a otros microorganismos del suelo. Debido a que su sistema de patogenia se basa en redirigir genéticamente el metabolismo de la planta para su propio beneficio, las distintas especies de Agrobacterium pueden considerarse “colonizadores genéticos”.

La transparencia 10 muestra los procesos celulares involucrados en las principales etapas de interacción entre Agrobacterium tumefaciens y una planta susceptible. Estos procesos son: A: Reconocimiento célula-célula. La colonización por Agrobacterium requiere la existencia de heridas en las raíces de la planta. Agrobacterium se desplaza hacia el tejido herido siguiendo un gradiente de concentración de señales químicas establecido por exudados del tejido vegetal. B, C y D: Corresponden a tres etapas consecutivas que involucran el procesamiento del ADN, el empaquetamiento de la hebra T luego de su escisión, y el transporte del complejo T desde la célula bacteriana hacia la célula vegetal. La transparencia

muestra una microscopía electrónica (C) del complejo T maduro, compuesto por el ADN T de simple cadena y las proteínas VirE y VirD. Este complejo es probablemente transportado a la célula huésped a través del pilus (señalado por flechas en D). E: Se muestra la importación del complejo T maduro al interior del núcleo de la célula vegetal. La foto muestra acumulación de proteína VirD fusionada a GFP en el núcleo, la que se observa como fluorescencia verde. F: Luego de la integración y expresión del ADN bacteriano al genoma vegetal se observa la formación del tumor de agalla. El tejido indiferenciado prolifera desde el sitio de la herida y secreta distintas opinas que son catabolizadas específicamente por Agrobacterium.

La porción de material genético transferido desde la bacteria que se integra al genoma de la planta corresponde a una región de un plásmido residente en la bacteria denominado plásmido Ti (transparencia 11). La región que es transferida recibe el nombre de ADN o hebra T (indicada en el esquema como región T) y está flanqueada por dos repeticiones directas denominadas borde derecho (BD) e izquierdo (BI). Los plásmidos Ti tienen un tamaño de entre 200 y 800 Kpb. La región T corresponde a una secuencia de ADN de entre 10 y 30 Kpb y comprende tanto los oncogenes (genes responsables de la síntesis de auxinas y citoquininas) como los genes involucrados en la síntesis y el transporte de opinas. La región de virulencia (vir), comprende varios operones bacterianos que participan en la escisión de la hebra T y en la formación del intermediario de transferencia (complejo T). La región vir comprende unos 40 Kpb. Otros elementos importantes localizados en los plásmidos Ti son los orígenes de replicación y de transferencia (oriT, implicado en el proceso de conjugación bacteriana) y las regiones que contienen genes responsables del catabolismo de las opinas.

Todos los plásmidos Ti tienen una estructura similar. Las especies de Agrobacterium sintetizan diferentes tipos de opinas y son referidas de acuerdo con ello. La transparencia 12 muestra las regiones de homología entre los plásmidos Ti de dos cepas comunes de Agrobacterium, una de octopina (oct) y otra de nopalina (nop). Dichas regiones abarcan principalmente la región T y la región vir. Una característica del plásmido Ti de octopina es que contiene tres regiones T cortas de 13, 1,5 y 7,8 Kpb, los cuales son transferidos independientemente unos de los otros, mientras que el de nopalina lleva un único plásmido Ti de 22 Kpb. Existen muchas otras opinas, tales como manopina, agropina agrocitopina, etc. En los plásmidos representados en esta transparencia se muestran cuatro regiones de homología que contienen respectivamente a los genes que codifican proteínas involucradas en la síntesis de auxinas y citoquininas (región A), el origen de replicación (región B), los genes que codifican proteínas involucradas en el catabolismo de octopinas y nopalinas (región C) y los genes de virulencia (región D).

La transparencia 13 muestra una representación esquemática de la región T. La región T está definida por dos repeticiones directas de 25 pb altamente homólogas. Tanto el borde derecho como izquierdo son importantes para el reconocimiento de las endonucleasas VirD1/VirD2 que estarían involucradas en la liberación de la hebra T. Sin embargo, el proceso de escisión tendría características polares, como lo sugiere el hecho de que la proteína VirD2 se une preferentemente al borde derecho (extremo 5’ de la hebra T). También se han identificado secuencias próximas al borde derecho que contribuirían a establecer la polaridad del proceso. En los plásmidos de octopina, una de estas secuencias (overdrive) incrementa el transporte del ADN T a la célula vegetal. La proteína VirC se une a esta secuencia favoreciendo el clivaje del borde derecho por la endonucleasa VirD1/D2. El borde derecho es requerido en forma absoluta para la patogenicidad de Agrobacterium tumefaciens, mientras que el borde izquierdo es prescindible.

Entre los bordes izquierdo y derecho se encuentran los genes que codifican para la síntesis de auxinas, citoquininas y opinas. En condiciones de alta concentración de auxinas y baja de citoquininas, el tejido vegetal se diferencia en raíces. Una situación inversa corresponde el desarrollo de tallos. La síntesis no regulada de auxinas y citoquininas induce el crecimiento indiferenciado del tejido vegetal y conduce, en el caso de una síntesis elevada de los dos tipos de hormonas, a la formación de tejido tumoral. Los oncogenes transferidos por Agrobacterium, si bien son controlados por promotores de tipo eucariota, no responden a los mecanismos de regulación endógenos. Como consecuencia, la integración del ADN T en el genoma de la planta, induce la desdiferenciación del tejido y el desarrollo de un tumor de agalla. El esquema de la transparencia 14 indica también la ubicación de la región overdrive (enhancer de la síntesis de la hebra T).

La colonización genética por Agrobacterium requiere la presencia de dos regiones localizadas en el plásmido Ti: 1) el ADN de la región T, cuya secuencia será transferida al genoma de la planta y, 2) la región de virulencia (vir), compuesta por siete loci principales (virA, virB, virC, virD, virE, virG y virH), que codifican la mayor parte de la maquinaria proteica involucrada en la transferencia del ADN T. Además de estas regiones, se requiere de un grupo de genes de virulencia localizado en el cromosoma de la bacteria (genes chv) que participan en los estadios tempranos de unión a las células de la planta. Las interacciones que tienen lugar durante la transformación genética mediada por Agrobacterium conforman un proceso que puede dividirse en ocho pasos distintivos, resumidos en la transparencia 15. 1) Agrobacterium reconoce y se une a la célula huésped. Esta unión es mediada por proteínas codificadas en el cromosoma de la bacteria y por receptores específicos de la célula huésped; 2) El sistema de traducción de señales de Agrobacterium reconoce señales químicas específicas de la planta; 3) La proteína virG media la transducción de señales y la activación transcripcional de los genes vir; 4) La formación de la copia de ADN T y del complejo T inmaduro; 5) La formación del complejo de transporte a través de las membranas de la bacteria y de la pared celular, compuesto principalmente por las proteínas de la familia VirB y la proteína VirD4, lo que permite la exportación de la hebra T y de las proteínas VirD2 y VirE1 al citoplasma de la célula vegetal; 6) La formación del complejo T maduro, formado por la hebra T y las proteínas VirD2 y VirE2; 7). La importación del complejo T al núcleo, proceso que es facilitado por proteínas de la planta entre las que se ha identificado a AtKAPa y VIP1; 8) El transporte dentro del núcleo y la integración del ADN T al genoma de la planta, mediado por VirD2/VirE2 y por factores nucleares. Se ha reportado que VirD2 es capaz de unirse a las ciclofilinas RocA, Roc4 y CypA, proteínas que actúan como chaperonas y contribuiría a mantener la conformación de VirD2. Otra proteína vegetal que se une a VirD2 es una fosfatasa tipo 2C (PP2C) es requerida para la acumulación de VirD2 en el núcleo. Finalmente, VirD2 también interacciona con AtKApa. Esta proteína, participa en la importación de proteínas que contienen sitios NLS al núcleo. A diferencia de VirD2, VirE2 no se une a AtKapa, pero si lo hace a otras dos proteínas VIP1 y VIP2. La proteína VIP1 es capaz de importar la proteína VirE1 al núcleo en un sistema de levaduras. A su vez, VIP2 no sólo se une a VirE2, sino también VIP1 en ensayos de doble híbrido. Por lo tanto, VIP1, VIP2 y VirE2 pueden funcionar como un complejo multiproteico facilitando y participando el transporte hacia el núcleo de la proteína VirE2 y contribuir así a la integración del complejo T. Además de AtKAPa y VIP1, se ha descripto que el complejo RAN, con actividad GTPasa, es requerido para la importación al núcleo en otros sistemas, sugiriendo que también participaría en la importación del complejo T al núcleo. Los análogos de GTP no hidrolizables bloquearían la importación al núcleo de las proteínas VirE2 y VirD2 por inhibición de RAN.

El reconocimiento y la unión de las células de Agrobacterium a la célula vegetal es esencial para el proceso de infección. Luego de un primer paso de unión, la bacteria sintetiza filamentos de celulosa que permiten el anclaje de ésta a la pared celular de la planta. Se han identificado varios genes cromosómicos (ChvA, chvB, pscA, att) que participarían del proceso de unión a la pared de la célula vegetal. Sin embargo, este proceso está poco caracterizado y la funcionalidad de estos genes en el proceso de anclaje no ha sido completamente dilucidada. Agrobacterium ha desarrollado un sistema regulatorio de dos componentes para reconocer la presencia de células huéspedes susceptibles, compuesto por una proteína de membrana (VirA) y una proteína citoplasmática (VirG). Estas proteínas actúan como un par receptor/transductor frente a moléculas provenientes de las heridas en la planta y promueven la transcripción de los genes vir (transparencia 16). El inductor mejor estudiado es la acetosiringona, un compuesto fenólico. Algunos monosacáridos, tales como glucosa y galactosa también contribuyen a la expresión de los genes vir. La señalización se inicia a través de compuestos fenólicos secretados por la planta los que se unen a la proteína VirA. Dos proteínas codificadas por genes cromosómicos de Agrobacterium, p10 y p21, contribuyen en este reconocimiento. La primera se uniría a los compuestos fenólicos y mediaría directa o indirectamente la unión a VirA. En cambio, la inducción de los genes vir por azúcares es mediada por otra proteína de origen cromosómico (ChvE) que une glucosa/galactosa e interactúa con VirA. VirA funciona como una proteín quinasa y como fosfotransferasa. En el primer caso, ocurre una autofosforilación en un residuo de histidina situado dentro de su región C-terminal, la que también contiene el dominio quinasa. La proteína VirA fosforilada se une a la proteína VirG que es a su vez fosforilada en un residuo aspartato. La forma fosforilada de VirG es mucho más estable y posiblemente permita maximizar los niveles de inducción de los restantes genes vir. La inducción de los genes vir ocurre cuando VirG fosforilado se une específicamente a los dominios vir, una secuencia conservada de 12 pb localizada en la región promotora de los genes vir.

Una vez inducidos los genes vir, se produce la escisión de la hebra T libre. Este evento se inicia en el borde derecho, continúa en dirección 5’-3’, y termina en el borde izquierdo de la hebra antisentido. Un complejo de proteínas denominadas VirD1/D2, que funcionan como endonucleasas específicas, se une a la forma supercoiled del plásmido Ti, relajan el plásmido, hace un corte entre la tercera y cuarta base de los bordes derecho e izquierdo en la hebra antisentido de la región T y liberan dicha hebra. La reacción de corte comprende la unión covalente de la proteína VirD2 al extremo 5’ del borde derecho. Luego, la maquinaria de síntesis de ADN repara la brecha entre los bordes derecho e izquierdo de la hebra antisentido. La proteína VirD2 permanece unida al ADN-T durante todo el trayecto hasta la célula huésped. Las proteínas VirD2 y VirE2 (una proteína de unión a ADN de simple cadena) junto con la hebra T constituyen el complejo T maduro. La unión de VirE2 ocurre antes de que la hebra T sea transportada a través del canal de pasaje a través de las membranas de la bacteria. Otra proteína recientemente identificada, la proteína VirE1, se une a VirE2, facilitando la unión de VirE2 al ADN, pero no interviene en la exportación de la hebra T a la célula de la planta.

Una vez formado el complejo T maduro, éste interactúa con distintos complejos proteicos involucrados en su exportación al citoplasma de la célula vegetal. El dispositivo de transporte del complejo T contiene alrededor de 12 proteínas que forman dos componentes funcionales: un complejo secretorio que transporta sustratos a través de la membrana celular y un pilus filamentoso. La transparencia 18 muestra un modelo que da cuenta de la estructura de estos complejos, elaborado sobre la base de evidencia indirecta. El complejo secretorio está compuesto por la proteína codificada por el gen virD4 y por un conjunto de proteínas codificado por el operón virB, el que contiene once marcos abiertos de lectura. El pilus está compuesto

mayoritariamente por la proteína VirB2 y, en menor proporción, por la proteína VirB5. El pilus censaría el contacto con la célula vegetal y traduciría la información al complejo secretorio para iniciar la exportación del complejo T. Se piensa que la proteína VirB1 tiene actividad transglucosilasa e interviene en la degradación de los peptidoglicanos bacterianos. Las proteínas VirB3 y VirB4 promoverían el ensamblado del pilus. Además de VirD4, VirB4 y VirB11 poseen también actividad ATPasa. Se asume que el transporte del complejo T implica la hidrólisis de ATP y que por lo tanto se trata de un proceso de transporte activo. La proteína VirB6 participaría en la formación del poro del complejo secretorio de transporte. Se desconocen aún las funciones de las proteínas VirB7, 8, 9 y 10.

Luego de pasar al citoplasma de la célula vegetal el complejo T es transportado al núcleo de la misma. A diferencia de los elementos genéticos transponibles, el ADN-T no codifica proteínas necesarias para su transporte e integración. Por lo tanto, el ADN-T no contiene secuencias específicas y cualquier fragmento de ADN insertado entre los bordes de la región T será transferido e integrado al genoma vegetal. Las proteínas VirD2 y VirE2, que componen el complejo T, están directamente implicadas en el proceso de importación al núcleo vegetal. VirD2 contiene dos señales de localización nuclear (NLS) y VirE2 contiene una. VirD2 y VirE2 se unirían a proteínas de la planta involucradas con la importación e integración del ADN-T. Se ha reportado que VirD2 es capaz de unirse a las ciclofilinas RocA, Roc4 y CypA, proteínas que actúan como chaperonas y contribuiría a mantener la conformación de VirD2. Otra proteína vegetal que se une a VirD2 es la ya mencionada fosfatasa tipo 2C (PP2C) es requerida para la acumulación de VirD2 en el núcleo. Finalmente, VirD2 también interacciona con AtKApa. Esta proteína, de la familia de carioferinas, participa en la importación de proteínas que contienen sitios NLS al núcleo. A diferencia de VirD2, VirE2 no se une a AtKapa, pero si lo hace a otras dos proteínas VIP1 y VIP2. La proteína VIP1, como ya se dijo, es capaz de importar la proteína VirE1 al núcleo en un sistema de levaduras, e interactuar con VIP2. Por lo tanto, VIP1, VIP2 y VirE2 conformarían un complejo de proteínas que posibilita el transporte hacia el núcleo de VirE2 y contribuye así a la integración del complejo T.

Una vez en el núcleo, el complejo T participa de la integración de la hebra T al genoma de la planta. Se asume que tanto las proteínas VirD2 y VirE2 como otros factores nucleares proveen actividades que posibilitan este proceso. La transparencia 19 ilustra un posible modelo del mecanismo involucrado. La proteína VirD2 tiene actividad ligasa in vitro, lo que sugiere que podría participar en la ligación del extremo 5’ del ADN T al ADN de la planta. A este paso seguiría un paso de síntesis reparativa de la hebra complementaria en que intervendría la maquinaria nuclear de la planta. Sin embargo, otros estudios sugieren que la doble cadena se sintetizaría previamente a la integración al genoma vegetal. La proteína VirD2 tiene en su extremo C-terminal motivos presentes en la familia de las recombinasas. La proteína VirE2 se requeriría para la integración del extremo 3’ del ADN T. También se ha sugerido una participación de la histona H2A en el proceso de integración.

En resumen, podemos dividir el proceso de transformación mediada por Agrobacterium en cuatro tipos de interacciones diferentes: a) interacciones extracelulares, b) interacciones dentro de Agrobacterium, c) interacciones dentro de la célula vegetal, y d) interacciones en el núcleo de la célula vegetal (ver Anexo, transparencias 104-106).

Interacciones extracelulares (transparencia 104): Las proteínas bacterianas ChvA, ChvB, PscA y Att reconocen los receptores (proteínas tipo vitronectina) de la pared celular de la célula vegetal, resultando en la unión de las agrobacterias a la célula huésped. ChvE interacciona con azúcares y transfiere la señal a VirA, o VirA

interacciona con compuestos fenólicos, en forma directa o vía p10 y p21. Ambas vías de señalización resultan en la autofosforilación de VirA. La transferencia del grupo fosfato de VirA a VirG transmite las señales de la planta a la célula bacteriana, donde VirG activa la expresión de los genes vir.

Interacciones dentro de Agrobacterium (transparencia 105): Esta etapa comienza con la activación de los genes vir. Las proteínas VirB1, VirB3, VirB4, VirB6, VirB7, VirB8, VirB9, VirB10, VirB11 y VirD4 se ensamblan formando un complejo secretorio transmembrana, que junto con el pilus formado por VirB2/VirB5, funcionan como un canal que conecta la célula vegetal con la célula bacteriana. VirD1 y VirD2 forman un complejo de endonucleasas que con la ayuda de VirC1, cortan la cadena antisentido en los bordes del ADN T. Durante este proceso, VirD2 se une covalentemente al extremo 5’ de la hebra T generando un complejo T inmaduro. Este complejo T puede madurar por dos mecanismos diferentes: a) el complejo T inmaduro y VirE2 unida a VirE1 se exportarían a través del canal de manera separada. En la célula huésped, VirE2 y VirE1 se desunen y VirE2 se une a la cadena T, formando el complejo T maduro (ADN T, VirD2 y VirE2); ó b) VirE2 se une al ADN T en el citoplasma bacteriano, y el complejo T maduro es luego exportado. Interacciones dentro de la célula vegetal (transparencia 106, panel superior): Dentro del citoplasma de la célula vegetal, VirD2 interacciona con las ciclofilinas RocA, Roc4 y CypA para mantener su conformación, con la proteína AtKAPa para importar el complejo T dentro del núcleo y, posiblemente, con PP2C para regular esta importación. VirE2 interacciona con VIP1 para favorecer su importación al núcleo. Las interacciones VirD2-AtKAPa y VirE2-VIP1 resultan en una eficiente importación del complejo T al núcleo.

Interacciones en el núcleo de la célula vegetal (transparencia 106, panel inferior): Una vez en el núcleo, VIP1 y VIP2 podrían participar en el transporte intranuclear del complejo T, guiándolo al sitio de integración en el cromosoma de la planta. Finalmente, factores nucleares actúan en forma concertada con VirD2 y VirE2 para integrar la cadena T en el ADN cromosómico, resultando en una transformación genética estable.

Vectores basados en plásmidos Ti

Transparencias 20-31

La capacidad natural de Agrobacterium de introducir ADN en el genoma nuclear de la planta permitió desarrollar vectores basados en las secuencias del plásmido Ti de Agrobacterium. Se constató que, si se remueven todos los genes comprendidos dentro de la región T (oncogenes y genes de síntesis de opinas), no se afecta la transferencia e integración del ADN T. Sobre esta base, se desarrollaron vectores de expresión que permiten clonar genes de interés dentro de la región T. Existen dos tipos diferentes de vectores de transformación. Las partes A y B de la transparencia 21 muestran los fundamentos de un vector de tipo cointegrativo. El gen de interés es introducido dentro de un plásmido Ti mediante un paso de recombinación simple a partir del llamado vector intermediario (un plásmido común de trabajo para Escherichia coli). En este plásmido Ti, las secuencias comprendidas entre los bordes de la región T han sido reemplazadas por secuencias que permiten la cointegración del vector intermediario. Este plásmido Ti conserva también todos los genes comprendidos en la región v ir. La parte C de la transparencia ilustra un sistema basado en un vector binario. En éste, el gen de interés y los genes vir residen en dos replicones separados capaces de coexistir y replicarse autónomamente en Agrobacterium. El replicón que contiene el gen de interés (en general de tamaño pequeño) se denomina vector binario. El

replicón que contiene los genes vir se denomina plásmido Ti desarmado (obsérvese que la región T ha sido completamente eliminada de éste elemento). El desarrollo de vectores binarios y la disponibilidad de un amplio rango de cepas de Agrobacterium que contienen plásmidos Ti desarmados convirtieron a la transformación basada en esta bacteria en un método preferencial de transformación vegetal.

Inicialmente, el método para introducir ADN foráneo en un plásmido Ti cointegrado, como el que se muestra en la transparencia 22, requería introducir un replicón de tipo ColE1, como pBR322, dentro de la región T del plásmido Ti. El ADN que se integrable en la región T se clonaba en un derivado de pBR322 que portaba un gen de resistencia a un antibiótico. Este plásmido se introducía en la cepa de Agrobacterium y la cepa se seleccionada por resistencia a dicho antibiótico. Como el ColE1 no puede replicarse en Agrobacterium, el plásmido pBR322 deberá cointegrarse al segmento pBR322 homólogo de la región T para acceder a una expresión estable. La desventaja principal de esta técnica es que resulta engorrosa y poco accesible para laboratorios con poca experiencia en microbiología. La ventaja principal es que este sistema permite mantener al gen foráneo en un bajo número de copias dentro de un plásmido Ti de Agrobacterium. La transparencia muestra un ejemplo basado en un vector cointegrativo tradicional.

Los vectores binarios surgen como una alternativa al uso de los vectores cointegrativos debido a la fácil implementación de su uso en todo tipo de laboratorios. Estos vectores se basan en que la región T y los genes vir se encuentran en dos replicones separados. Cuando estos replicones son introducidos en Agrobacterium, los productos de los genes vir pueden actuar en trans sobre la región T procesando y transfiriendo el ADN T a la célula vegetal. El plásmido que contiene la región T es denominado vector binario, mientras que el replicón que lleva los genes vir se denomina plásmido helper o plásmido Ti desarmado. En general, el plásmido helper contiene deleciones de la región T y es incapaz de generar tumores. En la transparencia 23 se muestran cuatro tipos de plásmidos binarios, todos los cuales contienen genes con secuencias no homólogas que confieren resistencia a kanamicina. Los plásmidos binarios son pequeños y fáciles de manipular tanto en Escherichia coli como en Agrobacterium. Generalmente, contienen sitios múltiples para enzimas de restricción dentro de la región T donde puede clonarse fácilmente el gen de interés. Muchos de los primeros plásmidos binarios tienen los genes de selección para plantas cerca del borde derecho (por ejemplo, pBIN19). Más recientemente, los nuevos vectores binarios se desarrollaron con el gen marcador de selección para plantas más cerca del borde izquierdo, lo que asegura que el gen de interés sea transferido antes que el gen selector (por ejemplo, pGreen0029). Debe recordarse que el borde derecho precede borde izquierdo en la transferencia del ADN-T.

Muchos vectores fueron diseñados con propósitos específicos y contienen diferentes genes selectores, promotores y señales de poliadenilación. La tabla de la transparencia 24 refleja la optimización gradual experimentada desde la introducción de los primeros vectores. Ello ha permitido incrementar la flexibilidad de los sistemas de vectores para distintos usos en un amplio rango especies vegetales. Los genes selectores más comúnmente usados en bacterias son los de resistencia a kanamicina, gentamicina, tetraciclina y estreptomicina y/o espectinomicina. También ha ocurrido una progresiva reducción del tamaño de los plásmidos binarios. Los plásmidos pPZP poseen un origen de replicación pVS1 cuya secuencia es considerablemente más corta que las de otros orígenes de replicación, como pRK2 o Ri. Por ello, los vectores con orígenes de replicación tipo pVS1 tienen un tamaño menor comparado con los que poseen los orígenes de replicación pRK2 o Ri. El pGreen usa un locus de replicación

pSa más pequeño, subdividido en el origen de replicación pSa ori y el gen de la replicasa pSa (rep A). El gen de rep A proviene de un plásmido (psoup) de Agrobacterium y permite la replicación de pGreen en trans.

Los vectores binarios que hoy se utilizan proveen un amplio número de genes selectores para plantas. Esta gama de genes permite así responder a requerimientos de las técnicas de cultivo de tejidos y expandir el rango de especies transformables. De esta forma, se han desarrollado en muchos casos diversas versiones de un mismo vector binario. El vector pGreen, por ejemplo, permite realizar distintas combinaciones de genes selectores con el propósito de desarrollar protocolos de selección con uno o más marcadores. Este grado de flexibilidad permitirá también la incorporación de nuevos genes selectores en el futuro. En la mayoría de los casos, la selección se basa en el agregado de una sustancia tóxica para el tejido no transformado al medio de cultivo (selección negativa). Al expresarse en las células transformadas, el gen selector permite su supervivencia y la regeneración de plantas a partir de las mismas. Los genes de resistencia a antibióticos han sido frecuentemente utilizados como selectores. El más utilizado de ellos es el gen nptII que confiere resistencia al antibiótico kanamicina. Otros genes ampliamente utilizados son los que confieren resistencia a espectinomicina e higromicina y los que confieren resistencia a herbicidas, como glufosinato y glifosato. El uso de un determinado selector está vinculado con la susceptibilidad específica de cada especie vegetal, por lo que la transformación de una especie nueva implica generalmente ensayos con distintos selectores. Es conveniente disponer de más de un gen selector si se prevé la necesidad de retransformar una especie con varios transgenes de interés. El debate sobre el uso de genes de resistencia a antibióticos en plantas transgénicas comerciales promovió la búsqueda de selectores más aceptables para la percepción pública que no poseen propiedades tóxicas para el tejido (selección positiva). Asimismo, se han desarrollado diferentes estrategias para eliminar los genes selectores en el cultivo transgénico.

Una opción para evitar el uso de genes de resistencia a antibióticos u herbicidas es el uso de genes de selección positiva, llamados así, porque permiten la proliferación del tejido transformado e inhiben la del tejido no transformado, el que sin embargo no muere. Una de las estrategias más interesantes de selección positiva se basa en la utilización de las fuentes de carbono, para las cuales se han usado genes de origen bacteriano que permiten la modificación de manosa o xilosa (monosacáridos que no pueden ser directamente utilizados por las plantas) como genes de selección en la transformación de plantas. El ejemplo descrito en la transparencia 27 corresponde a la selección mediada por el gen de la manosa-6P isomerasa (man A), el que interviene en el pasaje de manosa-6P a fructosa 6P. Se compara la eficiencia de transformación de la remolacha utilizando el gen nptII y el gen man A. La parte A de la figura muestra la eficiencia (en porcentaje) de brotes transformados usando métodos de selección positiva (manosa-6P isomerasa) o negativa (nptII). En la parte B se observa el porcentaje de brotes capaces de enraizar usando uno y otro método. Este método de selección positiva se ha utilizado en otros cultivos como cebada, tomate y girasol.

Para evitar la presencia de marcadores resistentes a antibióticos se han desarrollado varios métodos que permiten su remoción del tejido transgénico. La estrategia más sencilla es la co-transformación de una misma célula con dos cepas de Agrobacterium portando construcciones diferentes, una conteniendo el transgén de interés y otra el gen selector. La base de esta estrategia consiste en que, de producirse la co-transformación, ambos transgenes se insertarán en diferentes regiones del genoma en forma no ligada, por lo cual será factible su segregación posterior en la progenie de la planta transgénica. Como una alternativa a la co-transformación, se han desarrollado varios sistemas que utilizan elementos transponibles y/o sistemas de recombinación

sitio-específico. Estos sistemas requieren la expresión simultánea de transposasas o recombinasas que promueven la deleción específica de la región que debe ser eliminada. La eliminación del gen selector y de la transposasa/recombinasa se realiza posteriormente por segregación genética. La transparencia 28 muestra el diseño de los dos principales tipos de vectores utilizados con este propósito. Los de Tipo 1 contienen al gen de la transposasa y al gen selector en el mismo cassette de expresión, mientras que, en los de Tipo 2, la transposasa es aportada en trans por un vector helper. En los vectores de Tipo 1, las secuencias Ds, sobre las cuales actúa la transposasa, flanquean al gen de interés; en los de Tipo 2, las secuencias Ds flanquean al marcador de selección. El gen de la transposasa se muestra como un componente integrante de los vectores de Tipo 1, mientras que en el caso de los de Tipo 2 debe ser introducido por cruzamiento a partir de plantas transformadas con una construcción independiente. Una desventaja de estos sistemas es que la eliminación y selección posterior de las secuencias indeseables en la descendencia consumen tiempos considerables. Estas estrategias no son viables en plantas de propagación vegetativa, para las cuales se han desarrollado métodos alternativos.

Un sistema menos complicado, como el que se muestra en la transparencia 29, implica la deleción de ADN mediante recombinación de regiones intracromosómicas (ICR) entre dos secuencias homólogas. Dado que la frecuencia de ICR es baja, esto permite una eficiente aplicación de este sistema. El vector de transformación diseñado (OattO-ICR, contiene dos regiones de 352 pb de la secuencia de unión (attP) del bacteriófago l que rodean al gen de resistencia nptII, al gen GFP y al gen tms2. A la izquierda del sitio attP, se encuentra la secuencia booster de transformación (TBS), que favorecería el apareamiento de las secuencias attP evitando la recombinación ilegítima; también se encuentra el gen efector que será integrado al genoma por el sistema attP (esquema superior). La recombinación homóloga entre las dos regiones attP permite delecionar un fragmento de 5.9 Kpb y produce un transgén que contiene el gen efector y la secuencia TBS (esquema inferior). El gen tms2 , usado como selector, codifica una enzima que convierte NAM (naftaleno acetamida) a la auxina ANA (ácido naftalen acético). Las plantas que expresan el gen tms2 producen altos niveles de auxina que evitan el desarrollo de raíces e inducen la producción de callos. Por lo tanto, cuando se elimina la región entre las secuencias attP, se habilita el desarrollo de raíces y se pueden identificar las plantas positivas. En la transparencia 30 se muestran resultados obtenidos utilizando el sistema descrito. Una construcción similar a la detallada previamente se introdujo en de explantos de hojas de tabaco y se seleccionaron callos resistentes a kanamicina. Después de tres a cinco meses se observó que varios brotes que se habían desarrollado mostraban una coloración blanca. Cuando se analizaron estos brotes por PCR se observó que habían perdido el gen de resistencia a nptII y el gen tms2. Para seleccionar plantas de tabaco transgénicas libres de marcador (panel A, se desarrollaron brotes verdes y blancos en medio conteniendo kanamicina). En el tejido blanco, que potencialmente ha perdido el marcador nptII, se ensayó la actividad del gen tms2 (panel B). En medio conteniendo NAM, las raíces con actividad tms2 produjeron abundantes callos en lugar de raíces (izquierda), mientras que las raíces regeneradas a partir de tejido blanco que han perdido el gen nptII, debido a que también perdieron el gen tms2, producen raíces normales (derecha).

El sistema que se muestra en la transparencia 31 se basa en un sistema inducible por estradiol, que permite la remoción de ADN en un sitio específico en plantas transgénicas de Arabidopsis, denominado CLX (por sistema de remoción de ADN Cre/loxP). Este sistema es controlado por otro sistema denominado XVE. Comparado con otros sistemas, el sistema CLX puede ser finamente controlado y es altamente eficiente. Este sistema puede usarse en todo tipo de regeneración de explantos, tanto

por organogénesis como por embriogénesis somática. El sistema de expresión inducible XVE se eligió para el sistema CLX. La recombinasa Cre del bacteriófago P1, que reconoce específicamente los sitios loxP, se ubicó bajo el control del sistema XVE. Dado que el promotor OlexA-46 tiene una expresión basal en células bacterianas, la secuencia que codifica Cre se interrumpió con un intrón para evitar su expresión en las mismas. El marcador de selección (gen nptII) se ubicó entre las unidades de transcripción XVE y cre. En este ejemplo, el gen reportero GFP es utilizado como gen de interés. Las tres unidades de transcripción están flanqueadas por los dos sitios loxP, de tal forma que la recombinación inducida por estradiol permite la remoción de todos estos componentes y la activación del gen GFP por el promotor G10-90.

Protocolos de transformación mediante Agrobacterium tumefaciens

Transparencias 32-37

Los protocolos de transformación por Agrobacterium tumefaciens son, en rasgos generales, muy similares. La base de la técnica radica en poner en contacto el explanto que se va a utilizar para transformar con la cepa de Agrobacterium crecida en condiciones apropiadas. De acuerdo con la cepa utilizada, el requerimiento de antibióticos puede ser diferente. En general, las cepas de Agrobacterium se cultivan en medio LB suplementado con MgSO4 en presencia de los antibióticos requeridos. El Agrobacterium se cultiva toda la noche a 27-28 ºC. En el caso de la transformación de hojas de tabaco, se cortan discos de hoja (explantos) de aproximadamente 1 cm de diámetro. El explanto se coloca en una caja de Petri que contiene medio MS líquido y el cultivo de Agrobacterium. Se incuba unos minutos en presencia de la bacteria y luego se pasa a un medio MS sólido en presencia de las hormonas ANA y BAP para inducir la formación de brotes. Luego, los explantos se traspasan a un medio MS sólido suplementado con los antibióticos requeridos para seleccionar sólo aquellos brotes que hayan incorporado el ADN-T y cefotaxime, un bacteriostático que inhibe el crecimiento de Agrobacterium. Los explantos se repican cada 3 semanas durante 2 meses. Cuando se obtienen los brotes, estos se pasan a medio MS sólido suplementado con los agentes de selección, pero en ausencia de hormonas para favorecer el desarrollo de raíces y tallos. Las plantas que enraízan en medio con selección se pasan a tierra en invernadero. La transparencia 33 ilustra este proceso. Panel A: control de selección: explantos que no fueron incubados con Agrobacterium para confirmar que el agente selector está actuando. Panel B: control de regeneración: para confirmar que las hormonas están actuando dado que en ausencia de agente selector se observa regeneración de brotes. Paneles C, D, E y F: transformantes en medio suplementado con hormonas y agente selector. En el panel F se observa que el brote es capaz de enraizar en medio suplementado con el agente selector.

La transparencia 34 ilustra la transformación de soja a partir de cotiledones mediante Agrobacterium y usando higromicina como agente selector. El uso de higromicina como agente selector disminuyó el número de escapes (plantas no transformadas). A: explantos obtenidos a partir de plantas de soja de 5 días de edad. B: cotiledones incubados en un medio conteniendo Agrobacterium. C: explantos incubados en medio de inducción de tallos durante 28 días, los primeros 14 días en ausencia de higromicina, y los segundos 14 días en presencia de higromicina. E, F, G: evolución de los explantos en medio selectivo conteniendo higromicina durante 4 meses. H: plantas seleccionadas in vitro de una altura de 4 cm. I: plantas transferidas a tierra en condiciones de invernáculo.

El protocolo de transformación de Arabidopsis thaliana por Agrobacterium es extremadamente simple y la eficiencia de transformación radica fundamentalmente en

el buen estado fisiológico de las plantas durante el proceso de transformación y fecundación. La transparencia 35 muestra pasos de este protocolo. Una vez que las plantas florecen (panel A), se prepara la cepa de Agrobacterium tumefaciens que lleva el gen de interés en un vector binario. El cultivo de Agrobacterium se resuspende en una solución de sacarosa al 5% y la planta se sumerge en la solución de bacterias dejando en contacto las flores durante unos segundos con agitación suave (panel B). Luego, las plantas se cultivan normalmente hasta la obtención de semillas (panel C). Una vez obtenidas, las semillas se recolectan, se secan y se esterilizan usando ácido clorhídrico. Las semillas transformadas se seleccionan durante 7 a 10 días en medio MS sólido en presencia del agente selector. El panel D muestra las plantas potencialmente transformadas que crecieron en el medio selectivo.

La transparencia 36 resume los tiempos estimados para cada uno de los pasos de un protocolo de una transformación estándar mediado por Agrobacterium tumefaciens. Estos tiempos son variables y dependen de la especie a ser transformada, la variedad elegida, el explanto utilizado y el protocolo elegido para la selección.

Otro de los usos posibles de los sistemas basados en A. tumefaciens, es la mutagénesis por inserción con ADN-T, insertándose éste teóricamente al azar en cualquier sitio de la eucromatina, y representando un marcador molecular de secuencia conocida (tag) en el sitio de inserción. Pueden generarse así colecciones de mutantes estables, para estudios de genética inversa.

Protocolo de transformación mediante Agrobacterium rhizogenes

Transparencias 38-42

Agrobacterium rhizogenes induce la formación de raíces en forma de cabellera (hairy roots, ver transparencia 39) en plantas dicotiledóneas debido a la incorporación del ADN-T contenido en el plásmido Ri al genoma de la planta huésped. Se muestra el sobre crecimiento de raíces en discos de remolacha transformadas con el plásmido Ri de A. rhizogenes.

Inicialmente, se pensó que la transformación vía Agrobacterium rhizogenes era un método de elección, dado la facilidad para rescatar plantas transformadas a partir de raíces inoculadas con esta bacteria, en comparación con las dificultades que implica el rescate a partir de tumores de Agrobacterium tumefaciens. Sin embargo, una vez que el plásmido Ti fue exitosamente desarmado y estuvieron disponibles vectores no oncogénicos, la transformación con Agrobacterium tumefaciens pasó a ser rutina y la utilización de Agrobacterium rhizogenes se vio restringida a usos específicos. Las plantas transformadas con Agrobacterium rhizogenes pueden rescatarse a partir de pelos de explantos transformados (cada pelo representa un evento individual de transformación), mediante el uso de medios hormonales adecuados. Sin embargo, las plantas transformadas y sus progenies son morfológicamente anormales (panel inferior de la transparencia 40) y presentan el denominado fenotipo Ri (entrenudos cortos, hojas retorcidas, etc.). La transformación de raíces por Agrobacterium rhizogenes ha encontrado una importante aplicación alternativa. Las raíces de las plantas en su estado natural son capaces de sintetizar una extraordinaria diversidad de metabolitos secundarios y las raíces transformadas tienen el potencial de capitalizar esta habilidad. Debido a que las raíces son capaces de proliferar indefinidamente in vitro con altas tasas de crecimiento, esta habilidad podría ser usada para la producción de altos niveles de metabolitos secundarios en cultivos en gran escala.

La transparencia 41 resume el procedimiento utilizado para la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes. Inicialmente, se clona el gen de interés en un vector intermediario que contenga el ADN-T del plásmido Ri. Luego, se transforma Agrobacterium rhizogenes con este vector intermediario, el que sólo se va a poder replicar como un cointegrado con el plásmido pRi. El cultivo de Agrobacterium rhizogenes se co-cultiva con los explantos (en este caso, tallos decapitados) y éstos se transfieren a un medio donde se induce la formación de raíces transformadas. Luego las raíces se transfieren a un medio apropiado para inducir la formación de tallos a partir de los cuales se regeneran plantas enteras. Las plantas genéticamente transformadas se transfieren a invernadero.

Genes reporteros

Transparencias 43-52

Los genes reporteros son ampliamente usados en muchos vectores de expresión para medir la actividad de distintas regiones reguladoras. Idealmente, un gen reportero debe ser fácil de ensayar, si es posible en condiciones no destructivas del tejido. Se requiere también que la actividad endógena asociada al gen reportero sea muy baja o inexistente en las plantas a transformar. Actualmente, se cuenta con un pequeño número de genes reporteros de uso frecuente, siendo los más utilizados el de la -glucuronidasa, la proteína de fluorescencia verde, los de luciferasa y, en menor grado, el de cloranfenicol acetiltransferasa. La transparencia 44 enumera los orígenes y tipos de ensayos que se utilizan para detectar las actividades asociadas con estos genes.

Los genes reporteros han utilizados desde muy temprano como indicadores de que la transformación vegetal realmente ha ocurrido. En general, los genes reporteros son codificados por enzimas que actúan sobre sustratos que normalmente no están presentes en la célula huésped. Uno de los genes reporteros más comúnmente utilizado en plantas es el gen de la -glucuronidasa (uidA) de Escherichia coli. La proteína GUS es bastante estable y conserva su actividad aún cuando está fusionada a otras proteínas. La actividad GUS puede detectarse a través de una sencilla reacción histoquímica usando una variedad de sustratos que están disponibles comercialmente. Desafortunadamente, la mayoría de los sustratos son caros y la reacción histoquímica es destructiva, por lo que este ensayo no puede realizarse en tejido vivo. Sin embargo, la detección de la actividad GUS es muy sensible, pudiéndose detectar a nivel de unas pocas células. La transparencia 45 muestra la tinción de óvulos, sacos embrionarios y lóculos enteros de Arabidopsis thaliana mediante la reacción histoquímica de la enzima -glucuronidasa luego de la infiltración con Agrobacterium tumefaciens. En este caso, el gen uidA está regulado por un promotor constitutivo y lo que se visualiza son los tejidos inicialmente transformados por este método. A: fotografía de una flor completa donde se observan varios óvulos teñidos. B: Fotografía ampliada de un segmento floral donde se pueden ver óvulos completamente teñidos y óvulos no teñidos. C: Tinción del embrión o saco embrionario, en vez del óvulo entero. D: Cavidad del lóculo completamente teñido.

Los genes reporteros son comúnmente usados para explorar la localización espacio-temporal de la expresión génica. Para ello, las regiones reguladoras de los genes que se desea estudiar son ligadas al gen reportero y las construcciones así obtenidas son transferidas al genoma de la planta. El panel de la parte superior de la transparencia 46 muestra la expresión del gen reportero uidA mediada por el promotor tejido específico AtpT2 en flores y frutos de Arabidopsis thaliana. 1) Expresión del gen uidA en flores, 2) La expresión del gen uidA es confinada a la porción entre la silicua y el pecíolo. 3 y 4). Cortes histológicos del fruto donde se observa la expresión del gen

uidA en células del estrato superior (3) y en algunas células del tejido vacuolar (4). El panel de la parte inferior de la transparencia muestra la expresión del gen reportero uidA bajo la regulación de un promotor tejido específico AtpT2 en raíces de Nicotiana tabacum. (5) y (6): Fotografías de las raíces completamente teñidas debido a la expresión del gen uidA. (7): Corte transversal de raíz mostrando la expresión del gen uidA.

Los genes reporteros se utilizan también para la puesta a punto y seguimiento de un sistema de transformación. La transparencia 47 muestra embriones cigóticos inmaduros de Zea mays co-cultivados con agrobacterias que portan una construcción en que el gen uidA es dirigido por un promotor constitutivo. En el panel A se observa la distribución de puntos azules (expresión transitoria del gen uidA) en embriones cigóticos de maíz. En el panel B se observa la expresión estable del gen uidA en callos que emergieron de un único embrión. El callo de la derecha no muestra actividad GUS porque proviene de un embrión no transformado. El panel C muestra un segmento de hoja aislada de una planta transgénica que expresa el gen uidA. La hoja de la derecha proviene de una planta no transgénica (control negativo). El panel D muestra plantas transgénicas de maíz en invernadero expresando el gen uidA.

Aequorea victoria es una medusa con puntos luminiscentes en sus bordes (transparencia 48, panel inferior izquierdo). La luz proviene de una masa de tejido amarillo que contiene entre 6.000 a 7.000 células fotogénicas. El citoplasma de estas células contiene los componentes necesarios para generar bioluminiscencia. Estos componentes son una fotoproteína que se activa por Ca2+ (aequorina) que emite luz azul y verde, y una proteína accesoria, la green fluorescent protein (GFP), que acepta energía de la aequorina y re-emite esta energía como luz verde. La fluorescencia intrínseca de la proteína GFP se debe a una unión covalente a un cromóforo que se forma por modificaciones postranscripcionales de la proteína y que involucran el ciclado y la oxidación de los residuos, 65-67 (Ser-Tyr-Gly). El ADNc de GFP fue clonado y expresado en varios organismos procariotas y eucariotas, como bacterias, levaduras, nematodos, Drosophila y mamíferos. La proteína GFP tiene las características de un gen reportero deseable. Su expresión es autónoma e independiente de la localización celular y se requiere solamente la presencia de luz UV o azul y de oxígeno para la emisión de la fluorescencia verde. Además, GFP permanece activa cuando otras proteínas se fusionan a su extremo C- y N- terminal, sin afectar tampoco la distribución o compartimentalización de la proteína fusionada. Sin embargo, la expresión de GFP en plantas presenta ciertos problemas que deben ser tenidos en cuenta: a) la fluorescencia endógena que puede presentar las plantas puede confundir la interpretación de los resultados; b) la presencia de secuencias que codifican intrones crípticos puede llevar a la síntesis de una proteína inactiva; c) la obtención de radicales libres debido a la fuerte expresión de GFP puede resultar en muerte celular. Para evitar estos problemas, se han realizado varias modificaciones a la secuencia codificante de GFP: a) el uso de codones fue modificado para evitar el reconocimiento de intrones crípticos por la maquinaria de splicing de la planta; b) la serina 65 se reemplazó por una treonina para aumentar la luminiscencia de la proteína original y c) se adicionaron señales de transporte que permitieron la expresión de GFP en organelas donde los efectos tóxicos pueden tolerarse mejor.

La transparencia 49 muestra la expresión de GFP bajo microscopio de epifluorescencia usando excitación de luz azul. En los paneles A y B se muestra la expresión del gen de GFP utilizando un promotor específico de polen (LAT59 de tomate). El polen expresando GFP se desarrolló como una herramienta para rastrear el movimiento del polen transgénico en el ambiente. Las fotos muestran polen de Nicotiana tabacum cv Xanthi que exhibe una segregación mendeliana 1:1 (A; 400x de aumento) y polen segregante transgénico y no transgénico sobre los pelos de la pata

de una abeja (B; 100x de aumento). Los paneles C y D muestran expresión de GFP en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana. El panel C muestra cuerpos fusiformes dentro del retículo endoplásmico en células corticales del tallo. La proteína GFP ha sido dirigida al retículo por adición de una secuencia de anclaje HDEL. El panel D muestra células epidermales de hoja que exhiben fluorescencia en los tonoplastos y sub-poblaciones de vacuolas dentro de una vacuola central. El panel E muestra un cultivo de células en suspensión de la línea BY2 de tabaco transformadas con el gen GFP, en las que se observa acumulación de la proteína GFP dentro del retículo endoplásmico.

La transparencia 50 muestra plantas de tabaco transgénicas que expresan el gen gfp bajo el promotor AtSUC2 de la proteína de transporte de sacarosa en células del floema de Arabidopsis thaliana. Las plantas AtSUC2-GFP se examinaron usando un microscopio confocal para localizar la expresión de GFP e identificar los patrones de desarrollo del floema en diferentes estadios del desarrollo. La parte superior de la transparencia muestra el desarrollo basipétalo del floema (desde la base hacia la punta de la hoja) de la vena mayor en los cotiledones. GFP se expresa inicialmente en la vena central (vena clase I; A y B) y luego se extiende hacia la punta de la hoja (vena clase II; C). Finalmente, se expresa alrededor de la base de la hoja (D, E y F). La parte inferior de la figura muestra el desarrollo acropétalo de la vena central en hojas inmaduras. La descarga de GFP dentro de las hojas inmaduras en desarrollo ocurre inicialmente desde la vena clase I (A y B), sigue por la parte basal de las venas clase II (C y D) y finaliza en la parte apical de las venas clase II (E y F).

Los genes reporteros no destructivos pueden usarse para observar el desarrollo de ciertos fenómenos biológicos en tiempo real. La transparencia 51 muestra la expresión de GFP en tabacos transgénicos de Nicotiana benthamiana. El gen gfp esta dirigido por un promotor constitutivo que permite su expresión en todos los tejidos. El propósito del ensayo es mostrar el desencadenamiento del fenómeno de silenciamiento génico postranscripcional en plantas transgénicas en las que este fenómeno ha sido inducido artificialmente. La presencia de la proteína GFP se revela por la aparición de color verde o amarillo bajo iluminación ultravioleta. En ausencia de GFP, el tejido se observa de color rojo debido a la fluorescencia de la clorofila. A: Hoja de una planta de Nicotiana benthamiana no transgénica que emite fluorescencia roja debido a la presencia de clorofila. B: Hoja de una planta transgénica de Nicotiana benthamiana que emite una fuerte fluorescencia verde debido a la expresión del transgen gfp. C: Planta transgénica para gfp infiltrada 18 d antes con Agrobacterium tumefaciens portador del gen reportero gfp en que se puede observar la progresión del silenciamiento de GFP en una hoja inferior (flecha).

Un gen reportero no destructivo menos utilizado (básicamente por el costo de los sustratos y por los tiempos implicados en el ensayo) es el de la luciferasa. La transparencia 52 muestra una planta de Nicotiana tabacum expresando el gen Luc de Photinus pyralis bajo el promotor constitutivo 35S de Cauliflower mosaic virus. La detección de fluorescencia se realizó sobre una película fotográfica expuesta por varios días a la emisión de la planta. El ensayo se basa en la medición de los niveles de luz producidas en una reacción catalizada por la enzima luciferasa:

luciferasaATP + luciferina + O2 oxiluciferina + ampicilina + PPi + CO2 + luz

La intensidad de luz emitida es proporcional a la actividad de la enzima luciferasa, la que a su vez es dependiente de la temperatura. La temperatura óptima para la actividad de la luciferasa es de entre 20 y 25 °C.

Sistemas de transferencia directa de ADN

Transparencias 53-99

Los diferentes métodos desarrollados para la transformación genética de plantas pueden agruparse en dos clases principales de acuerdo con el mecanismo utilizado para la transferencia de ADN. Como muestra la transparencia 4, en una clase se encuentran aquellos métodos basados en la utilización de vectores biológicos, como el Agrobacterium o los virus vegetales, y en otra clase, aquellos que consisten en la transferencia directa del ADN. El rango natural de hospedantes de Agrobacterium se constituyó en un importante factor limitante en los primeros intentos por transformar monocotiledóneas y algunas dicotiledóneas que no eran susceptibles a la bacteria. En consecuencia, se desarrollaron métodos alternativos de transferencia de ADN basados en procedimientos de naturaleza química, fisicoquímica, o mecánica. Estos nuevos métodos, conocidos como de transferencia directa, permiten transferir ADN desnudo sin la mediación de vectores biológicos. Entre estos últimos, se incluyen métodos tales como el bombardeo con micropartículas (biobalística), la permeabilización de membranas celulares inducida por corrientes eléctricas (electroporación) y/o por tratamientos químicos con policationes (PEG, PVP) o fusógenos lipídicos, la abrasión con fibras de carburo de silicio y la microinyección. El bombardeo de micropartículas es el más ampliamente utilizado.

Los métodos de transferencia directa presentan diversas ventajas y desventajas al ser comparados con los métodos mediados por vectores biológicos. Entre las ventajas: a) son considerados universales porque, al no incluir organismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie, independientemente de su susceptibilidad a la infección por parte de los mismos. Es decir, que su expresión no será dependiente de la interacción vector-hospedador; b) no requieren la eliminación de las células del organismo vector de los tejidos o plantas transgénicas, como sucede en la transformación mediada por Agrobacterium; c) las construcciones son más simples y pequeñas, ya que no son necesarias secuencias particulares, como las de la región vir o los bordes del plásmido Ti; d) es más fácil la co-transformación con dos o más genes; e) son útiles para estudiar función y regulación génica, como así también actividad de promotores, ya que en este tipo de métodos la expresión transitoria suele ocurrir en forma muy temprana. El transgén puede ser transcripto en el núcleo y traducido en el citoplasma independientemente de su integración al genoma nuclear. Entre sus desventajas: a) pueden conducir a una alta frecuencia de re-arreglos del transgén; las células transformadas generalmente contienen secuencias fragmentadas del transgén y del vector en varios sitios del genoma; b) la inserción de múltiples copias del transgén es más frecuente que en el caso de los sistemas basados en vectores biológicos. Estas dos cuestiones implican que en la transformación directa existe una mayor probabilidad de ocurrencia del silenciamiento génico, tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. Por regla general, con el fin de atenuar su incidencia de este fenómeno, se recomienda tomar ciertas precauciones: a) reducir el número de transgenes a transferir, b) evitar el uso de múltiples copias del mismo promotor o terminador y c) evitar el uso de promotores y transgenes con un alto grado de similitud a promotores o genes endógenos.

Transformación por biobalística o bombardeo de micropartículas

Transparencias 55-82

El término “biobalística” deriva de la conjunción de “biológico y balística” o dicho de otro modo “balística biológica”. Es común referirse a este método como bombardeo de partículas, bombardeo de micropartículas, aceleración de partículas, método del cañón génico, etc. La biobalística fue ideada y refinada por John Sanford, Theodore Klein, Edward Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell en los años 80. Este procedimiento consiste en la utilización de partículas microscópicas (microproyectiles) cubiertas con moléculas de ADN o de ARN que son acelerados a alta velocidad para atravesar la pared y las membranas celulares. Una vez que las partículas son atrapadas en las células, el ARN puede ser traducido directamente o el ADN puede ser transcripto y traducido, lo que permite observar expresión transitoria entre 24 y 72 horas después del bombardeo. Si las partículas bombardeadas son atrapadas en el núcleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un proceso de recombinación al azar, lo que se considera como un evento de transformación estable. La transformación estable ocurre a muy baja frecuencia, por lo que es necesario utilizar un sistema de selección in vitro que permita distinguir células transformadas y no transformadas. El primer cañón génico era similar a una pistola de calibre 22 en la que un percutor generaba una explosión de pólvora impulsando una bala de plástico (macroproyectil) con las partículas de metal (microproyectiles) y ADN o ARN, hacia el tejido blanco.

En 1987, Klein et al. reportaron que era posible introducir ADN plasmídico en células epidérmicas de Allium cepa mediante bombardeo con partículas de tungsteno, y que el gen marcador cat de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa era expresado en niveles muy altos. Poco después, numerosos investigadores pusieron a prueba este método en diferentes organismos obteniendo resultados positivos. Desde entonces, el bombardeo de micropartículas se constituyó en el segundo método de transformación genética de plantas más empleado, luego del de Agrobacterium. El bombardeo de micropartículas es considerado un mecanismo universal, ya que, por su naturaleza, permite introducir ADN desnudo virtualmente en cualquier tipo de tejido o célula. Ha sido utilizado para introducir y expresar material genético no sólo en el genoma de plantas superiores sino también en bacterias, protozoarios, algas, hongos, células y tejidos animales (insectos, peces, aves y mamíferos) y aún animales y plantas in vivo. Hasta el presente, constituye el único medio que permite transformar organelas celulares, como mitocondrias y cloroplastos de modo reproducible.

Se han identificado varios parámetros físicos, químicos y biológicos que interactúan entre sí y que condicionan la eficiencia del bombardeo de micropartículas y la integración del material genético transferido. En consecuencia, al establecer un protocolo de transformación, es necesario optimizar cada parámetro en forma independiente, priorizándolos por la magnitud de sus efectos, y luego determinar sus interacciones en una escala más limitada. En la transparencia 58 se enumeran los factores que influyen en la transferencia del ADN y los relacionados con las construcciones genéticas utilizadas. La transparencia 59 enumera los factores biológicos que condicionan la eficiencia de un ensayo biobalístico en relación con el tejido blanco a ser utilizado en la transformación.

Desde la aparición del primer dispositivo para bombardeo de micropartículas en los años 80, se han desarrollado diferentes cañones génicos con el objetivo de refinar la técnica, incrementando su seguridad, simplicidad y eficiencia. Además, se procuró dañar menos el tejido, aplicar una mayor aceleración a las micropartículas y bajar los costos de operación. Los nuevos diseños incluyen en su mayoría: a) el uso de una

fuerza impulsora reproducible y precisamente regulada; b) el uso de un macroproyectil que permite acelerar a las micropartículas depositadas sobre su superficie. Además, en general, estos dispositivos incorporaron una cámara de vacío en la que se realiza el disparo, lo que permite disminuir la desaceleración de las micropartículas por el rozamiento con el aire. La transparencia 60 enumera distintos sistemas de impulsión basados en: a) explosión química de pólvora seca; b) descarga de helio a alta presión; c) descarga de aire, CO2 o N2 comprimido; d) descarga eléctrica de alto voltaje y baja capacitancia o de bajo voltaje y alta capacitancia; e) flujo de partículas o flujo de helio a baja presión por aspersión; f) flujo de helio con cañón de precisión. La elección del sistema de impulsión influye considerablemente en el número de partículas que impacta por unidad de área bombardeada. La figura de la transparencia 60 muestra el cañón génico original ideado por Sandford y colaboradores.

El cañón génico desarrollado inicialmente en la Universidad de Cornell (transparencia 56) operaba de forma similar a una pistola, en la que un macroproyectil acelerado por explosión de pólvora liberaba una salva de microproyectiles metálicos revestidos de ADN en el interior de las células blanco. Los primeros bombardeos se efectuaron con microproyectiles de tungsteno de 4 m de diámetro suspendidos en H2O, depositados sobre un macroproyectil de Teflón. El macroproyectil era acelerado por explosión de pólvora a una velocidad de unos 800 m/seg hacia las células blanco situadas a 10-15 cm de la salida del cañón. Como se muestra en el esquema, luego del impacto, el macroproyectil quedaba retenido en una placa de retención ubicada en la extremidad del tubo de aceleración. Los microproyectiles eran impulsados hacia el tejido blanco a través de un orificio existente en la placa. Aunque el modelo de pólvora permitió la transferencia de ADN a diferentes especies, las dificultades para controlar la potencia del disparo en forma reproducible y el daño físico provocado a las células limitó el número de transformaciones estables.

Entre las modificaciones más notables introducidas al diseño de los cañones génicos figura el reemplazo de la carga de pólvora por presión de gas para generar el impulso de las micropartículas. El primer dispositivo que utilizó esta forma de impulsión fue el cañón PDS-1000 de Dupont, basado en una descarga de helio o nitrógeno comprimido. El modelo más utilizado en la actualidad es el cañón de alta presión de helio PDS-1000/He, el que fue patentado por Dupont y es comercializado por la compañía BioRad (transparencias 61 y 62). El mismo consta de los componentes necesarios para la transferencia de alta presión de helio (regulador del helio, válvula solenoide, tubos conectores, membrana de ruptura), de un componente portador del macroproyectil y de una cámara principal en donde se bombardea el tejido blanco en condiciones de vacío parcial. Al accionar el sistema, se establece vacío dentro de la cámara de disparo y el helio es liberado hacia la misma luego que la membrana de ruptura se rompe por exceso de presión. El movimiento del helio a alta velocidad impulsa el macroproyectil que porta las micropartículas recubiertas de ADN, las que son así aceleradas hacia el tejido blanco. Este dispositivo asegura una aceleración reproducible de las micropartículas y los tejidos resultan menos dañados que en el caso de los cañones impulsados por pólvora.

Las transparencias 63-64 ilustran los distintos pasos del procedimiento de bombardeo. El primer paso involucra la preparación de las micropartículas, la precipitación del ADN sobre las mismas y el ensamblaje de las distintas partes del cañón que comprenden el sistema de impulsión de los microproyectiles. Para ello, se desenrosca el soporte de la membrana de ruptura, se escoge una membrana de ruptura del espesor apropiado y se la coloca en el soporte correspondiente. A continuación, se ajusta el soporte al extremo del tubo de salid de gas. El espesor de la membrana de ruptura varía según la presión de helio con la que se quiera trabajar (existen membranas que van de los 300 psi hasta los 2.200 psi). La presión de ruptura determina el poder de la onda de

choque que impacta en la cámara. Si se incrementa la presión de helio, se incrementa la aceleración de las micropartículas y, en consecuencia, su penetración en el tejido blanco.

La transparencia 64 ilustra los pasos siguientes en la preparación del cañón para el bombardeo. Una vez que se ha colocado el macroproyectil sobre su respectivo retén, se toma una alícuota de las micropartículas recubiertas de ADN y suspendidas en H2O o etanol y se la deposita sobre el mismo. Cuando la alícuota se seca, el retén es invertido (de manera tal que los microproyectiles queden enfrentados con las células blanco) y colocado en el lanzador. En el mismo dispositivo, se agrega una malla de retención que frenará al macroproyectil luego de completar su desplazamiento. En principio, cualquier material puede ser empleado como micropartícula transportadora de ADN, siempre que sea de alta densidad, químicamente inerte y de tamaño y formato adecuados. Las micropartículas metálicas de oro o tungsteno son las más utilizadas. Las de tungsteno son de formato irregular, de tamaño de 0,2 a 3 m. Su costo es bastante reducido, por lo que son comúnmente elegidas. Sin embargo, son potencialmente tóxicas para algunos tipos de células y están sujetas a oxidación rápida, con la consecuente degradación del ADN. Las micropartículas de oro son biológicamente inertes, de formato redondeado y de tamaño más uniforme de entre 0,6 a 3 m. Su principal desventaja es su alto costo. Las características mencionadas deben ser evaluadas en distintos tipos de células blanco de modo de optimizar el proceso de bombardeo.

La transparencia 66 muestra un esquema de los parámetros que pueden variarse en el dispositivo de un cañón génico y de las relaciones existentes entre las principales variables y la velocidad de los microproyectiles. En cada bombardeo realizado con el cañón PDS1000/He, la velocidad que alcanzan los microproyectiles es condicionada por: a) la presión de helio elegida; b) la presión negativa alcanzada en la cámara de disparo; c) la distancia (A) entre la membrana de ruptura y el macroproyectil; d) la distancia (B) de desplazamiento del macroproyectil desde su posición original hasta el impacto contra la malla de retención; e) la distancia (C) de desplazamiento de los microproyectiles desde la malla de retención hasta el tejido. Variando la presión y las distancias (A, B y C), se puede modificar la velocidad de los microproyectiles, lo que permite optimizar los protocolos según el objetivo de transformación y tejido blanco.

Existen modelos alternativos al cañón PDS 1000/He que permiten regular la presión del gas a la cual se desea producir el bombardeo. La regulación se efectúa por medio de una válvula eléctrica, dentro de un rango de presiones de 200 a 1500 psi. Al accionar un control eléctrico, la fuerza electromagnética generada por un solenoide produce el desplazamiento de una aguja que perfora las membranas de ruptura permitiendo la salida del helio (en contraste con el cañón PDS1000/He en que la membrana de ruptura se rompe pasivamente por exceso de presión). El dispositivo que se muestra en la transparencia 67 fue desarrollado en EMBRAPA-CENARGEN (Brasil) y ha sido utilizado exitosamente en la transformación de Glycine max, Phaseolus vulgaris, Gossypium hirsutum, entre otros.

El Genebooster (transparencia 68) es otro tipo de cañón génico, producido por ELAK (Budapest) y desarrollado por el Centro de Biotecnología Agrícola del Instituto de Ciencias Vegetales de Hungría. Mediante este dispositivo, las partículas son impulsadas hacia el tejido blanco por liberación de nitrógeno comprimido a alta presión. En este caso, los controles de presión y vacío se encuentran en una unidad separada de la cámara de disparo. El proceso de disparo es controlado por un sistema electrónico automático. La energía del disparo es ajustada según el espesor de la pared celular del tejido blanco. Los ajustes de los parámetros de cada disparo pueden ser archivados por una computadora conectada al dispositivo. Este cañón ha sido

usado con éxito en la transformación de Oryza sativa y también para obtener expresión transitoria en estudios de promotores específicos para diferentes tejidos (hoja, hipocótilo, embrión, escutelo, callo, cotiledón) de varias especies vegetales. Entre sus ventajas, pueden mencionarse: a) control automático de los disparos; b) registro computarizado de los ajustes de cada disparo; c) control continuo de la energía de disparo; d) alta penetración a través de paredes celulares; e) alta frecuencia de transformación en especies recalcitrantes; f) bajo costo (gas barato, placas de retención reciclables).

En 1996 hizo su aparición la pistola génica de mano como una alternativa al cañón PDS 1000/He. En contraste con los cañones génicos convencionales, en que el tamaño del tejido blanco está limitado por el tamaño de la cámara y el explanto es sujeto a vacío durante el bombardeo, este nuevo diseño no requiere vacío, permite trabajar con virtualmente cualquier tipo de células o tejido blanco y provee una herramienta para transformar organismos in vitro o in vivo. El instrumento que se muestra en la transparencia 69 es comercializado por la compañía BioRad. La pistola trabaja con microproyectiles de oro recubiertos de ADN o ARN que son precipitados en la pared interna de un cartucho de plástico y acelerados por un flujo de helio a presión. Es posible preparar 50 cartuchos a la vez conteniendo cantidades conocidas de microproyectiles, los cuales pueden conservarse hasta dos meses previos a su utilización. Los cartuchos se colocan en un soporte (figura C), el cual se ensambla en la pistola y se dispara. El sistema es rápido, versátil y permite la co-transformación con más de un transgén. En la práctica los dos sistemas de helio, el cañón PDS1000/He y la pistola Helios, se complementan, dado que en el primero el vacío provee condiciones ambientales más controladas en su cámara de disparo, mientras que el último permite trabajar con una amplia variedad de tejidos o células blanco, incluidos organismos vivos. La transparencia muestra la pistola génica (figura A), el porta cartuchos (figura C), y un dispositivo (figura B) utilizado para preparar hasta 50 cartuchos por vez. El esquema inferior muestra el diseño interno de la pistola génica.

La pistola génica constituye una valiosa herramienta para transferir ADN o ARN en organismos vivos sin utilizar cámara de vacío. Debido a que la pistola puede ser dispuesta muy cerca del tejido a ser bombardeado, la trayectoria de las partículas es reducida y la desaceleración por fricción es muy baja. Estos cambios reducen el trauma en tejidos frágiles y facilitan las manipulaciones. Sin embargo, los parámetros de bombardeo deben ser ajustados de acuerdo con el tipo de tejido blanco. Algunos reportes mencionan que una desventaja del sistema es la poca reproducibilidad entre experimentos. Sin embargo, este problema es frecuente en todos los sistemas de bombardeo de partículas. Algunos autores recomiendan tomar recaudos especiales para controlar mejor este problema, tales como trabajar con material vegetal crecido en las mismas condiciones o utilizar explantos de misma edad fisiológica.

La expresión transitoria temprana de genes reporteros es extremadamente útil en el monitoreo de la eficiencia de transferencia génica y en el ajuste de los parámetros de bombardeo. Asimismo, la expresión transitoria es sumamente utilizada para estudios de regulación y función génica, especificidad de promotores, etc. Las figuras de la parte superior de la transparencia 71 muestran la expresión transitoria del gen uid A en embriones inmaduros de centeno. Las diferencias en la expresión del gen se relacionan con el uso de diferentes cantidades de microproyectiles para el bombardeo: (figura A) 200 g; (figura B) 100 g; (figura C) 30 g. Las figuras de la parte inferior muestran la diferencia de expresión transitoria del gen uid A observada en hojas de Arabidopsis thaliana bombardeadas con una pistola génica Helios (presión de disparo, 75 psi) usando 125 g de micropartículas de oro y 1 g de ADN por disparo; con o sin malla difusora de micropartículas (A y B respectivamente).

El Geneboy es una pistola de mano ELAK (Budapest) y desarrollado por el Centro de Biotecnología Agrícola del Instituto de Ciencias Vegetales de Hungría. Mediante este dispositivo las micropartículas son impulsadas hacia el tejido blanco por liberación de CO2 a presión. Pueden utilizarse contenedores manuales de gas de diferente capacidad para múltiples disparos. Esta pistola se ha utilizado con éxito en la producción de plantas transgénicas de maíz. Este sistema permitió la transferencia de ADN in vivo en tejidos meristemáticos de especies leñosas como durazno, manzana, etc. Entre sus ventajas más importantes, caben mencionar: a) bajo costo; b) no requiere uso de cámara de vacío; c) alta eficiencia de penetración a través de paredes celulares; d) alta frecuencia de transformación en especies recalcitrantes; e) fácil manejo en condiciones de campo.

Otro sistema biobalístico alternativo se basa en la tecnología ACCELL™, desarrollada por la compañía Agracetus para permitir el máximo de flexibilidad de ajuste, blanco y penetración celular. Esta tecnología involucra el uso de una descarga eléctrica a alto voltaje para evaporar una gota de H2O. Los microproyectiles recubiertos de ADN son dispuestos sobre un disco de metal (macroproyectil) y posicionados en una cámara de vacío (transparencia 72). Una expansión explosiva generada por la descarga eléctrica (aproximadamente 14 kV desde un capacitor de 2 F) en una gota de agua acelera el complejo macroproyectil-microproyectiles hacia las células blanco. La penetración del tejido blanco puede ser finamente regulada variando la intensidad de la descarga eléctrica. Mediante este procedimiento, las partículas pueden ser dirigidas a una capa específica del tejido. Esta capacidad es un atributo importante del sistema, aún cuando explantos idénticos de diferentes genotipos de la misma especie pueden requerir diferentes condiciones de aceleración para una óptima penetración de las partículas. La aceleración provocada por la descarga eléctrica reduce el impacto provocado en las células blanco, en comparación con los sistemas basados en propulsión por gases. Sin embargo, a pesar de haber sido usado con éxito en la transformación de numerosas especies y de las ventajas operativas del sistema, este sistema no ha sido adoptado en forma generalizada para la transformación de plantas.

Un dispositivo de bajo costo, que puede usarse como alternativa a los instrumentos más sofisticados, es el cañón de chorro de partículas (PIG; Particle Inflow Gun). El mismo puede ser fácilmente construido en el laboratorio con medios relativamente económicos. Este cañón hace uso de una válvula eléctrica para generar un chorro de helio a baja presión, el cual acelera las micropartículas dentro de una cámara de vacío (28-30 pulgadas de Hg) y las proyecta hacia las células blanco. La micropartículas recubiertas de ADN son dispuestas en una jeringa con filtro que se acopla a un adaptador conectado a la válvula solenoide. Este instrumento ha sido exitosamente usado para transformar Glycine max, Zea mays, Manihot esculenta y Musa spp. Existe una versión del PIG en el cual se ha eliminado la cámara de vacío y que se ha usado para transformar Oryza sativa. A pesar del bajo costo del sistema, su uso no ha sido tan difundido como el de los cañones mencionados anteriormente.

Sautter et al. desarrollaron un diseño alternativo de cañón génico que combina características del método de microinyección con la biobalística. Fue ideado para el bombardeo de meristemas apicales y permite apuntar el disparo en áreas de 100 a 200 m de diámetro. El tejido blanco es montado sobre una capa de agarosa en una gota de alginato. No utiliza macroproyectiles y el ADN no es precipitado con los microproyectiles sino mezclado con los mismos y transferido en conjunto con los mismos en una pequeña gota de líquido desde un tubo capilar conectado a un tubo Pitot. Para romper la gota, se usa un flujo de CO2 o de N2 a alta presión que forma un aerosol y fuerza a las partículas a través de una pequeña apertura (aspersión de gotas microscópicas). A partir de allí, las partículas son aceleradas a través de un capilar a

una cámara con vacío parcial en que se encuentra el tejido blanco. La longitud de este último capilar determina la velocidad de las partículas y su diámetro determina el área de impacto en determinadas condiciones de vacío, presión y distancia de trabajo. Los parámetros de disparo pueden adaptarse dentro de un amplio rango. Un dispositivo de enfoque permite dirigir las partículas a un meristema individual. Como se muestra en el esquema de la derecha, el área del blanco es determinada con una mira. En el mismo, se observa el meristema apical de una plántula de cereal luego del bombardeo y la distribución de las partículas bajo la mira utilizada para apuntar el cañón. El área apuntada tiene un diámetro de 150 m. La segunda capa celular, que dará origen a las células germinativas, se señala con el dibujo de los núcleos. Este sistema ha sido utilizado en diferentes plantas como Triticum aestivum, Sorghum bicolor y otras gramíneas, aunque los resultados obtenidos no satisficieron las expectativas para lo cual fue diseñado.

La transparencia 73 muestra ejemplos de especies de monocotiledóneas transformadas por biobalística, junto con el tipo de tejido blanco, genes reporteros y genes marcadores de selección usados.

uid A: gen de la enzima -glucuronidasa de Escherichia coli.cat: gen de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa de Escherichia coliluc: gen de la enzima luciferasa de Photinus pyralisbar: gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicuscsr-1/als: gen de una forma alterada de la enzima sintasa del ácido acetohidroxil, también conocida como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana.hpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa de Escherichia coli.npt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli.

A diferencia de la transformación vía Agrobacterium, los procedimientos de transformación por biobalística no requieren el uso de vectores especiales. Como fuente de ADN para el bombardeo, es posible utilizar los plásmidos comúnmente usados en las manipulaciones de ingeniería genética conteniendo las construcciones genéticas de interés. En algunos casos, se ha obtenido mayor eficiencia de transformación cuando los plásmidos son linealizados. El promotor más ampliamente utilizado para inducir la expresión de genes en plantas es el promotor constitutivo 35S del virus del Mosaico de Coliflor (CaMV; Cauliflower mosaic virus). Generalmente, este promotor brinda altos niveles de expresión en dicotiledóneas. Sin embargo, no ocurre lo mismo en monocotiledóneas, en las que se utilizan en forma alternativa promotores como el del gen ubi1 (ubiquitina) de maíz y el del gen act1 (actina) de arroz. La tabla de la transparencia 74 muestra ejemplos de promotores utilizados en la transformación de cereales y de sus actividades relativas.

Emu: Promotor modificado de alcohol deshidrogenasa de maízAct1-Act1 intrón1: Promotor e intrón de actina de arrozUbi1-Ubi1 intrón: Promotor e intrón de ubiquitina de maíz35S: Promotor de 35S de CaMV35S-Adh1 intron 1: Promotor de 35S de CaMV e intrón de alcohol deshidrogenasa de maíz

La transparencia 75 muestra ejemplos de especies de dicotiledóneas transformadas por biobalística junto con los tejidos blanco, genes reporteros y genes marcadores de selección que demostraron ser eficientes.

uid A: gen de la enzima -glucuronidasa de Escherichia coligfp: gen de la proteína de fluorescencia verde de Aequorea victoriabar: gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicushpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa de Escherichia colinpt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli.

csr-1: gen de una forma alterada de la enzima sintasa del ácido acetohidroxil, también conocida como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana.

Al elegir un tejido blanco para la transformación por biobalística, nuevamente debe tenerse en cuenta la capacidad de la especie de interés para regenerar in vitro. Entre los explantos vegetales utilizados con mayor éxito, se encuentran las suspensiones celulares, meristemas, embriones en desarrollo, embriones maduros, embriones somáticos, primordios foliares, cotiledones y callos. En la transparencia 76 se muestran algunos explantos comúnmente usados en protocolos de biobalística. Una de las estrategias ampliamente utilizadas para favorecer la recuperación de los tejidos luego del bombardeo es la aplicación de baños en antioxidantes para prevenir la oxidación de los explantos. Para facilitar el ingreso de los microproyectiles en el núcleo celular, los explantos suelen ser cultivados en medios conteniendo sustancias osmóticas (como manitol) que provocan plasmólisis reversible de las células. Así, la menor turgencia de las células, hace que las mismas resulten menos dañadas por el impacto de los microproyectiles. Por otro lado, el pasaje de los explantos a medio fresco previo al bombardeo aumenta la tasa mitótica, favoreciendo así la integración del ADN foráneo al genoma vegetal.

El bombardeo de micropartículas ofrece una alternativa altamente eficiente e independiente del genotipo para la transformación de Oryza sativa. A la fecha, han sido transformadas más de 40 variedades de arroz por esta técnica. Los explantos más utilizados son embriones inmaduros y callos derivados de semillas. El antibiótico preferentemente usado como selector es higromicina. El procedimiento se basa en el bombardeo de embriones inmaduros a partir de los cuales se obtienen callos en medio selectivo. Estos callos puede dar lugar a la regeneración de plantas transgénicas en medios conteniendo los reguladores de crecimiento adecuados.

La transparencia 77 muestra resultados de transformación de Oryza sativa utilizando el sistema de bombardeo con micropartículas. En este caso, los explantos bombardeados son callos embriogénicos de 6 variedades de élite que expresaron actividad GUS positiva 24 hs después del bombardeo. Se les transfirió simultáneamente el gen bar y el gen hpt. Se obtuvieron plantas completas a partir de callos cultivados en selección con higromicina y glufosinato de amonio. En las figuras, se observan los callos embriogénicos transformados, la expresión transitoria del gen uid A en los mismos, y la regeneración de brotes a partir de los callos en selección con glufosinato de amonio.

La transformación por biobalística puede implementarse eficientemente no sólo en el caso del arroz, sino también en otras especies de monocotiledóneas como Festuca arundinacea. La transparencia 78 ilustra el procedimiento de transformación de esta especie basado en la inducción de callos embriogénicos y en el establecimiento posterior de suspensiones celulares embriogénicas. Estas suspensiones celulares son utilizadas como tejido blanco para la transformación por biobalística. Luego del bombardeo, éstas son puestas en selección con higromicina. En la transparencia se diferencian las suspensiones celulares transgénicas (resistentes a la selección y de color amarillento) de las suspensiones susceptibles a higromicina, de color marrón.

La biobalística es una de las técnicas más ampliamente utilizadas en la transformación genética de Glycine max (soja). Desde hace más de 10 años, se han documentado numerosos eventos de transformación por bombardeo de micropartículas que incluyen el uso de distintos dispositivos de aceleración como los cañones PDS 1000/He, PIG, o Accell, mencionados anteriormente. Las variedades transgénicas comerciales tolerantes al herbicida glifosato han sido obtenidas por biobalística. Los tejidos o suspensiones embriogénicas de soja, así como también los meristemas apicales son

los explantos más utilizados en esta especie. En cuanto a los agentes de selección, el antibiótico higromicina y el herbicida imazapyr han sido reportados como los más eficientes. La transparencia 79 muestra diferentes etapas en el proceso de transformación de soja. Los cultivos embriogénicos, derivados de cotiledones inmaduros, fueron bombardeados con un cañón génico PDS 1000/He y puestos en medio de selección con higromicina. Aquellos explantos que sobrevivieron a la selección, continuaron siendo cultivados a través de diferentes estadios embrionarios hasta su conversión en plantas completas. En la foto B puede observarse la expresión transitoria del gen uidA en un ensayo histoquímico.

La biobalística también ha sido un instrumento eficiente para la transformación de Manihot esculenta Crantz (mandioca) a partir de cotiledones. En la transparencia 80 se observan cotiledones bombardeados (figura A) con un cañón génico de chorro de partículas (PIG), que expresan transitoriamente el gen uidA. A partir de los cotiledones se obtuvieron brotes en selección con higromicina (figuras B y C), los cuales regeneraron plantas completas (figuras D y E). Se constató la expresión estable del gen uidA en hojas (figura F).

Las figuras de la transparencia 81 muestran la expresión transitoria del gen que codifica la Proteína de Fluorescencia Verde (GFP) en embriones somáticos de Glycine max (figuras A y B) y Triticum aestivum (figuras C, D y E) y la expresión estable del mismo gen en hojas de Petunia hybrida (figura F). Todos los explantos fueron bombardeados con un cañón génico de chorro de partículas (PIG).

Junto con los métodos basados en Agrobacterium tumefaciens, el bombardeo de micropartículas es una de las técnicas más usadas para la transformación genética de plantas. Asimismo, el bombardeo con micropartículas se ha usado con éxito para transformar animales, microorganismos y organelas como cloroplastos y mitocondrias. El método es sumamente útil para analizar la función y regulación génica, encarar problemas que requieren expresión transitoria o integrativa, transferir ARN viral y estudiar vías metabólicas. Tradicionalmente se ha adherido el ADN a microproyectiles de oro o tungsteno para ser transferido, pero también se ha hecho lo mismo con bacterias, levaduras o fagos. Asimismo, se ha utilizado el sistema de bombardeo como estrategia complementaria en la transformación mediada por Agrobacterium para provocar orificios en los tejidos blanco y facilitar así la entrada de la bacteria. Sin embargo, las técnicas de bombardeo presentan limitaciones tal como se discutirá más adelante. Algunas especies oponen una resistencia natural a la penetración de las partículas, dada por cutículas endurecidas, paredes celulares lignificadas o superficies vellosas. La principal limitación del método continúa siendo la baja relación entre el total de células sometidas al bombardeo y el número de células que logran incorporar de manera permanente el transgen.

Transferencia de ADN mediada por electroporación y/o métodos químicos

Transparencias 83-93

Otro sistema de transferencia directa de ADN se basa en la permeabilización de las membranas plasmáticas de los protoplastos para favorecer el ingreso del material genético. Las paredes celulares representan barreras físicas significativas para la transferencia de ADN, mientras que los protoplastos, por tratarse de células desprovistas de paredes celulares, constituyen un tipo de explanto blanco más apropiado. La obtención de protoplastos requiere la incubación de tejido vegetal en un medio suplementado con enzimas fúngicas pectocelulolíticas para digerir las paredes celulares, siendo necesario en algunos casos el agregado de hemicelulasas. Las

celulasas y hemicelulasas degradan la pared celular, en tanto que las pectinasas digieren la matriz de pectina que mantiene adheridas a las células. El uso de enzimas disponibles comercialmente posibilitó el aislamiento de protoplastos de prácticamente cualquier tejido vegetal, siempre que el mismo no esté lignificado.

Luego de la digestión, los protoplastos deben ser aislados y lavados. Por otro lado, con el objetivo de optimizar la transferencia de ADN a protoplastos, se utilizan distintas técnicas que incrementan la permeabilidad de las membranas plasmáticas. Es común el uso de policationes tales como polietilenglicol (PEG), polivinil alcohol (PVA) y DEA-dextrano que actúan como fusógenos e incrementan la endocitosis del ADN debido a que sus cargas positivas interaccionan con las cargas negativas del ADN y de la membrana plasmática. Además del uso de fusógenos, los tratamientos con Ca2+ y calor pueden incrementar la precipitación del ADN. La obtención de la primera planta transgénica viable derivada de protoplastos de Nicotiana sp. se reportó en 1984. La transformación de protoplastos en soluciones que contienen PEG provee frecuencias relativamente bajas de plantas transgénicas. Sin embargo, debido al gran número de células disponibles en estos sistemas, si se dispone de buenos métodos de selección y de protocolos de regeneración eficientes, es siempre posible obtener plantas transgénicas. Una contribución a la transformación mediada por PEG fue la fusión con liposomas. En este caso, el ADN es previamente incorporado a liposomas, a partir de las cuales es transferido a las células. Los liposomas están constituidos por lípidos de carga neutra similares a los que componen la membrana plasmática y pueden ser producidos en diversos tamaños. El ADN es empaquetado in vitro y luego transferido a los protoplastos. Para hacer más eficiente la fusión se utilizan tratamientos con PEG u otros policationes. Aunque el sistema es muy laborioso y la eficiencia de transformación es baja, se ha reportado la obtención de plantas transgénicas de tabaco y trigo por esta técnica. La transparencia 84 muestra un esquema representativo del aislamiento y purificación de protoplastos de hojas de Nicotiana tabacum. Las hojas cosechadas son puestas en contacto con la solución enzimática durante 16 h, al cabo de las cuales se procede a separar los protoplastos del tejido no digerido.

Un método alternativo para permeabilizar las membranas celulares y facilitar el ingreso del ADN es la electroporación, la que consiste en exponer a las células vegetales a intensos campos eléctricos para provocar la apertura de poros y promover la captura del ADN. Los protoplastos se obtienen siguiendo los pasos mencionados en la transparencia anterior, se incuban luego en una solución buffer conteniendo el ADN (plásmido con el gen de interés y el gen de selección) y son expuestos a pulsos eléctricos de alto voltaje y de duración variable. El campo eléctrico causa la formación de poros reversibles en la membrana plasmática, permitiendo así el pasaje de ADN a la célula. Se han determinado las condiciones óptimas para la transformación de células de distintas especies, incluyendo la intensidad del campo eléctrico, la densidad de protoplastos y la composición del buffer de cultivo. La electroporación sola no produce altas tasas de transformación, pero la eficiencia puede incrementarse acoplándola al uso de policationes como el polietilenglicol (PEG). La transformación por electroporación ha sido documentada en una amplia variedad de especies y tipos de tejidos, pero la disponibilidad de protocolos de regeneración de plantas enteras a partir de protoplastos resulta una limitante en la mayor parte de los casos. La transparencia 85 muestra los pasos a seguir para la transformación de protoplastos de tabaco por electroporación. Se muestran también distintas tipos de cubetas y electroporadores comerciales.

La transparencia 86 muestra distintas fases del cultivo de protoplastos electroporados con un gen que confiere resistencia a kanamicina y de la regeneración de plantas de Nicotiana tabacum a partir de los mismos. A: protoplastos luego de la electroporación;

B: protoplastos cultivados en división; C: protoplastos formando callos en medio con kanamicina (izquierda) y sin kanamicina (derecha); D: plantas en medio de enraizamiento con kanamicina (planta resistente a la izquierda y planta no resistente a la derecha); E: plantas floreciendo; F: germinación en medio selectivo. Las plantas transgénicas continúan desarrollándose mientras que las no transgénicas se tornan cloróticas.

La transparencia 87 muestra un esquema de la transformación de protoplastos de Oryza sativa por electroporación. En este protocolo, la formación de callos de los cuales se obtienen los protoplastos se induce a partir de semillas. Luego de la electroporación, los protoplastos son cultivados en medio líquido junto a células nodrizas de tabaco, las que han sido elegidas por su alta tasa mitótica. Los factores mitogénicos secretados por las mismas inducen la división de los protoplastos. Como se muestra en el panel inferior, los protoplastos pueden cultivarse mezclados con las células nodrizas o separados de las mismas por membranas de tipo Millicell (filtro de nylon, papel de filtro Millipore u hoja de celofán). Uno de los agentes selectores que mejor actúan en arroz es el antibiótico higromicina. En este caso, se realizó una doble selección con higromicina de los callos obtenidos a partir de protoplastos electroporados antes de inducir la regeneración de plantas completas.

Es también posible co-transformar protoplastos por electroporación. En la transparencia 88 se muestra una etapa del protocolo de transformación de protoplastos de arroz con dos plásmidos diferentes. Uno de los plásmidos porta el gen hmr de resistencia a higromicina y el otro, el gen de interés no seleccionable más el gen reportero uidA. Luego de la electroporación, los protoplastos son cultivados en medio suplementado con higromicina. Los protoplastos que resisten la selección son cultivados en un medio con reguladores de crecimiento para estimular la regeneración de la pared celular y la división celular. Las células se dividen formando colonias y tras sucesivos subcultivos en diferentes medios regeneran plantas completas por organogénesis o embriogénesis. Un porcentaje considerable de los protoplastos electroporados incorpora simultáneamente el gen de resistencia a higromicina, el gen de interés y el reportero y, en consecuencia, las plantas derivadas de éstos poseen los dos genes. Para diferenciar estas plantas de aquellas derivadas de protoplastos que sólo incorporaron el gen de selección, es necesario determinar la presencia de los genes de interés en un análisis posterior. Generalmente, esto se realiza utilizando la técnica de PCR e iniciadores específicos.

La transparencia 89 muestra fotografías del aislamiento, cultivo y electroporación de protoplastos de Citrus sinensis (naranjo dulce) obtenidos a partir de callos embriogénicos y del proceso posterior de regeneración de plantas completas. Los explantos expresan de forma transitoria y estable el gen de la Proteína de Fluorescencia Verde (gen gfp), el que ha sido utilizado como gen reportero.

La tabla de la transparencia 90 muestra ejemplos de especies vegetales transformadas por métodos químicos (fusión mediante policationes, tratamiento con liposomas) y/o por métodos de electroporación de protoplastos. Se informan los genes de selección y los agentes selectores usados. Aunque la transformación de protoplastos resulta un método relativamente simple y efectivo, no se utiliza con mucha frecuencia, especialmente por la escasa disponibilidad de protocolos optimizados para regenerar plantas a partir de protoplastos.

Si bien la electroporación se utiliza como técnica de transformación de bacterias y protoplastos, también ha sido empleada para transferir ADN a células o tejidos intactos, es decir que presentan paredes celulares. Los explantos vegetales utilizados en este caso pueden ser microesporas, polen, fragmentos de hoja, embriones, callos,

semillas o yemas. En algunos casos, los explantos son pre-tratados con soluciones enzimáticas (degradación parcial de las paredes celulares) o heridos en forma mecánica para facilitar la entrada del ADN. Se han reportado resultados positivos de la transformación de células o tejidos intactos por electroporación de Oryza sativa, Nicotiana tabacum, Triticum aestivum, Zea mays, Citrus sp, etc. La transparencia 91 muestra un dispositivo (figura A) usado para transformar embriones de Triticum aestivum. La electroporación se realiza en una cámara especial en la que los embriones son montados en gotas de alginato sobre discos de agarosa (figuras B, C, y D). Durante la electroporación los embriones quedan en contacto con el buffer de electroporación enfrentados con el cátodo de la cámara de electroporación (figura D).

La transparencia 92 muestra diferentes tejidos de Coffea arabiga (cafeto) electroporados sin pretratamiento enzimático (figuras A y B) y con pretratamiento enzimático (figuras C-F) en los que se observa expresión transitoria del gen uidA. Los embriones somáticos en estado de torpedo resultaron ser los explantos más apropiados para la transformación por electroporación. Este hecho se manifiesta en el incremento de la frecuencia de expresión transitoria del gen uidA y en un aumento de la capacidad regenerativa de los embriones. El autor de este trabajo concluye que el pretratamiento con enzimas facilita el ingreso del ADN.

La transparencia 93 muestra los resultados de la transformación de pro-embriones de Nicotiana tabacum mediante electroporación sin previa permeabilización de las membranas. Los pro-embriones expresan transitoriamente los genes reporteros uid A y gfp.

Transformación con whiskers de carburo de silicio

Transparencias 94-95

En 1990 se reportó una nueva técnica de transferencia de ADN que utiliza fibras muy finas, conocidas como whiskers, para generar orificios en las paredes celulares. Las fibras más utilizadas en este método son cristales de carburo de silicio de 0,3-0,6 m de diámetro y 10-100 m de longitud. Las fibras de silicio se agregan a una suspensión conteniendo el tejido vegetal (por ejemplo suspensiones celulares, embriones o callos) y ADN plasmídico, y luego se mezclan con un agitador tipo Vortex. Como resultado de la agitación, los whiskers penetran la pared celular y la membrana plasmática, permitiendo el ingreso del ADN. La eficiencia de la técnica depende del tamaño de la fibra, los parámetros de mezcla (agitación), la forma de los recipientes utilizados, el material vegetal y las características de las células vegetales, especialmente el espesor de la pared celular. Las principales ventajas de este método residen en su bajo costo y en la rapidez y sencillez con que pueden realizarse los ensayos. Sus principales desventajas son la baja eficiencia de transformación, la disminución de la capacidad regenerativa de los tejidos dañados por el proceso y la necesidad de trabajar con extrema precaución debido a la toxicidad del carburo de silicio para la salud humana. Aunque el proceso ha sido utilizado con callos friables, este tipo de callo está limitado a unos pocos genotipos de maíz y avena. Muchos cereales producen callos embriogénicos muy compactos y duros que no son fácilmente transformables por este método. Sin embargo, se han introducido mejoras a la técnica que permitieron la transformación transitoria y estable de Oryza sativa, Triticum sp., Hordeum vulgare, Zea mays, Nicotiana tabacum, Lolium multiflorum, Lolium perenne, Festuca arundinacea y Agrostis stolonifera, sin necesidad de iniciar suspensiones celulares. La transparencia 95 muestra la transformación de suspensiones celulares de maíz con whiskers de carburo de silicio. Las suspensiones celulares fueron puestas en una solución conteniendo los whiskers y el ADN

plasmídico portando los genes uidA y bar. La mezcla fue agitada con la ayuda de un dispositivo de tipo Vortex (figura A). La incorporación del ADN fue corroborada por la expresión transitoria del gen uidA (figura B). Las células transformadas formaron callos en selección con fosfinotricina (figura C) y regeneraron plantas transgénicas (figuras D, E y F). El tratamiento con herbicida reveló que las plantas han heredado el gen bar en forma mendeliana (figura F). Este trabajo fue el primero en que se reportó la producción de plantas transgénicas mediante whiskers de carburo de silicio.

Transferencia de ADN por microinyección

Transparencias 96-99

La microinyección es un método de transferencia directa, mediante el cual se inyecta ADN en las células utilizando pipetas microcapilares de vidrio bajo control microscópico. Esta técnica se utilizó por primera vez en células animales durante los años 40, cuando se hizo posible la generación y manipulación de microagujas, y su uso se extendió posteriormente a las células vegetales. La técnica requiere de un micromanipulador y se realiza bajo microscopio. Durante la transferencia de ADN, cada célula es inmovilizada con una pipeta succionadora. Las células microinyectadas se dejan recuperar en una gota de medio suspendida en una cámara húmeda y, posteriormente, son cultivadas in vitro para regenerar plantas. La microinyección fue ideada principalmente para la transformación de grandes células animales, como las huevas de los peces. Sin embargo, se han desarrollado protocolos para microinyectar ADN en protoplastos, cultivos embriogénicos, células en suspensión y estructuras multicelulares vegetales. La microinyección de protoplastos requiere inmovilizar a los mismos en gotas de alginato, polilisina o agarosa. La microinyección presenta varias ventajas: a) requiere pequeñas cantidades de ADN; b) puede aplicarse virtualmente a cualquier tipo de célula; c) permite la inyección conjunta de ADN con otras moléculas biológicamente activas; d) permite regular el número de moléculas a transferir; e) puede monitorearse a las células blanco durante y después de la transferencia de ADN; f) permite la introducción no sólo de ADN sino también de cromosomas dentro de las células. Por todas estas características, constituye un método muy aplicable al estudio de funciones celulares y de la fisiología de plástidos. Sin embargo, su aplicación a la transformación de plantas ha sido muy limitada hasta el presente debido a las dificultades para penetrar la pared celular mediante micropipetas e inyectar el núcleo celular (generalmente la vacuola celular ocupa un volumen preponderante). La presión de turgencia de las células vegetales suele dificultar también el procedimiento de inyección. Utilizando este método, se han obtenido plantas transgénicas de Nicotiana tabacum, Petunia sp., Brassica napus y Hordeum vulgare.

La microinyección de fluorocromos, anticuerpos, proteínas y material genético es ampliamente utilizada por los biólogos a pesar de sus desventajas relacionadas con la inserción de microcapilares. En células pequeñas, el sellado de la membrana plasmática alrededor de la herida provocada por la punta de la pipeta (alrededor de 0,7 m de diámetro) es a menudo incompleto. Además, en la mayoría de las células vegetales y en algunos casos de animales la alta presión celular exacerba los problemas de sellado, después de la penetración de la pipeta la presión celular se distiende porque los líquidos celulares son forzados a entrar al capilar. Desafortunadamente en células vegetales muy turgentes como elementos de plantas superiores, la pérdida de presión celular es acompañada por un drástico cambio en la ultraestructura celular. Sin embargo, la pérdida de ultraestructura no ocurre cuando las células son tratadas con capilares de 0,1 m. En comparación con los capilares convencionales, esta minúscula punta de pipeta reduce el daño celular y la pérdida de

turgencia. Aparentemente, las fuerzas físicas en esta punta extremadamente fina amortiguan la turgencia celular previniendo cambios bruscos de solutos. Sin embargo, la inyección de material a través de capilares de alrededor de 0,1 m de diámetro requiere de alta presión para superar la resistencia al penetrar la célula. En tal sentido, las formas convencionales de ejercer presión resultan insuficientes debido a que no producen la presión adecuada o no permiten un control preciso sobre la extrusión de la muestra.

En la transparencia 98 se muestra el diagrama de una femtojeringa (figura C) que permite introducir muestras del orden de femtolitros en células y organelas con un mínimo daño. El método de microinyección que utiliza esta microjeringa se basa en la expansión inducida por calor de un metal líquido (galistán: galio, indio y estaño) dentro de la pipeta para forzar la muestra desde la punta microcapilar y es adecuado para la transferencia de fluorocromos y construcciones de ADN en cianobacterias y organelas subcelulares. En la figura D se observa el sostén y calentador con la bomba y la resistencia que genera la energía necesaria para expandir el metal. También se observan dos fotos (figura A y B) donde se compara una punta de pipeta convencional con la punta de la femtojeringa. Finalmente, y a modo de ejemplo de su uso y resultados, se presentan fotos con imágenes de microscopía confocal de Lucifer yellow inyectada en una cianobacteria, en cloroplastos de Vicia faba y en el núcleo de células de Xenopus distal.

¿Biobalística versus Agrobacterium tumefaciens ?

Transparencia 100

La transformación genética de plantas se remonta a principios de los años 80, década en que se demostró la capacidad del Agrobacterium para transferir ADN a células vegetales. Durante las décadas siguientes, se realizaron avances significativos en mejorar los sistemas basados en Agrobacterium, así como en desarrollar nuevos métodos que permitieron la transferencia directa de ADN. Entre estos últimos, se incluyen métodos como el bombardeo de micropartículas (biobalística), la permeabilización de membranas celulares por corrientes eléctricas (electroporación) y/o por tratamientos químicos con policationes (PEG, PVP) o fusógenos lipídicos, la abrasión con fibras de carburo de silicio y la microinyección. Si bien varios de los sistemas de transferencia directa han resultado en aplicaciones exitosas, el bombardeo de micropartículas es actualmente el más ampliamente utilizado. Por otra parte, aunque existen muchos reportes sobre el uso de virus como vectores, Agrobacterium resulta el vector biológico más usado para la transformación vegetal. La biobalística fue desarrollada como una alternativa para resolver la ausencia de interacción entre muchas especies vegetales y las distintas cepas de Agrobacterium. Sin embargo, desde la década del 90, el uso de cepas supervirulentas de la bacteria ha permitido la obtención de plantas transgénicas en especies que hasta ese momento no eran susceptibles a Agrobacterium y que, por el contrario, habían podido ser transformadas por biobalística. Por su parte, el uso de los cañones génicos está limitado por la capacidad regenerativa de las células bombardeadas y por la integración estable del ADN. Además, la biobalística ha evidenciado una alta frecuencia de integración de secuencias re-arregladas y/o truncadas, como también la inserción de múltiples copias del transgén, lo que redunda en una alta probabilidad de ocurrencia de silenciamiento génico. Por el contrario, el Agrobacterium produce generalmente integraciones que involucran a una o a pocas copias del transgén. Este aspecto ha determinado que, siempre que sea posible, la mayoría de los investigadores prefieran la técnica basada en Agrobacterium. Sin embargo, deben considerarse también las crecientes evidencias que muestran que la inserción del ADN

por la bacteria no es tan definida como se creía anteriormente. En este sentido, se ha hallado que secuencias de ADN ubicadas fuera de los bordes de la región T de Agrobacterium pueden integrarse también en el genoma de la planta receptora. Además, la persistencia de Agrobacterium en los tejidos de las plantas regeneradas es otro problema que aún resta resolver y que tiene implicancias sobre aspectos de bioseguridad. Por estas razones, aunque existe una tendencia a elegir el método de Agrobacterium para transformar plantas, tanto éste como la biobalística seguirán constituyendo sistemas complementarios durante muchos años.