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Ensayos Microbiolgicos Teora

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UNIDAD DE TRABAJO N 5

TCNICAS DE TOMA Y PREPARACIN DE LA

MUESTRA: HOMOGENEIZACIN Y DILUCIN.

NDICE.

1. INTRODUCCIN.

2. TCNICAS DE TOMA DE MUESTRAS.

2.1.-Definicin de muestreo.

2.2.-Nmero de muestras.

2.3.-Concepto de muestra nica.

2.4.-Condiciones que deben cumplirse en la toma de muestras.

2.5.- Toma de muestras de alimentos.

2.6.-Identificacin de las muestras.

3. TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE MUESTRAS.

4. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANLISIS.

4.1.-Preparacin de una muestra con exceso de flora y acompaante.

4.2.-Muestras slidas o pastosas que es necesario licuar.

4.3.-Muestras con una elevada carga bacteriana.

4.3.1.-Diluciones decimales seriadas.

4.3.2.-Empleo de la escala de MacFarland.

4.3.3.-Otras suspensiones de muestra y colonias bacterianas

5. PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTES MICROBIOLOGICOS.


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1. INTRODUCCIN.

En esta unidad de trabajo nos ocuparemos de un conjunto de aspectos previos al anlisis

microbiolgico en s. Nos referimos a las tcnicas de seleccin, toma y preparacin de muestras, as

como a su transporte y conservacin. La importancia de estas tcnicas no debe ser subestimada,

pues un defecto en cualquiera de ellas puede invalidar los resultados del anlisis microbiolgico.

Podemos citar algunos ejemplos de esto. Para realizar un recuento de bacterias en el agua

corriente hay que dejar el grifo abierto durante un tiempo largo antes de tomar la muestra. Si se

toma la muestra nada ms abrir el grifo y este lleva varios das sin abrirse, el agua del ltimo tramo

de caera llevar estancada all el tiempo suficiente para que pueda haber habido crecimiento

bacteriano. Por lo tanto, la muestra contendr muchas ms bacterias que el agua corriente de la red

general y los resultados del anlisis no sern ciertos para el agua corriente.

Otro ejemplo: los gonococos (Neisseiria gonorrhoeae) mueren rpidamente a la temperatura

de un frigorfico. Si una muestra de exudado uretral de un paciente con gonorrea se refrigera para

intentar conservarla durante su traslado al laboratorio, los gonococos morirn y el anlisis dar un

resultado negativo a pesar de que el paciente s sufre una infeccin por esta bacteria.

El problema de la contaminacin de los alimentos por los microorganismos es algo conocido

de antiguo. Dicha contaminacin implica en muchos casos un peligro sanitario y/o una prdida del

valor comercial del producto. Por estos motivos el problema ha sido frecuentemente considerado en

la legislacin, con el fin de establecer una serie de normas que controlen la calidad microbiolgica

de los alimentos y permitan disminuir al mximo los riesgos, sanitarios y comerciales, que la

presencia de microorganismos puede implicar.

Como consecuencia de todo esto, los anlisis microbiolgicos de los alientos se realizan de

forma frecuente y rutinaria. Sin embargo muchas veces se olvida un factor importante a tener en

cuenta en dichos anlisis, y es que si la muestra del alimento que se analiza no es una muestra

representativa de la partida completa que se pretende valorar, el resultado puede no tener

significacin real. Esto incluye, tanto el nmero y la distribucin de las unidades de muestra

tomadas, como la forma en la que se toman y manejan esas unidades de muestra.

Por muestreo de alimentos, ya sea destinado a su anlisis microbiolgico o al de otras

caractersticas, se entiende la operacin que consiste en separar un cierto nmero de unidades de

muestra de un lote, remesa, partida, etc., con el fin de obtener unos resultados analticos fiables y

representativos. Es necesario realizar un muestreo ya que, obviamente, no es posible someter un

lote completo a dichos anlisis, ya que sera demasiado destructivo y costoso. Por esto mismo, al

igual que prcticamente todos los estudios que realiza el hombre, lo que se hace es extrapolar los

resultados obtenidos a partir de la fraccin del lote analizada en la muestra al lote completo.

Desde un punto de vista ideal, un lote es una cantidad de alimento producida y manipulada

bajo condiciones uniformes. En la realidad slo se puede aplicar este concepto a la cantidad de

alimento producido en un periodo de tiempo limitado, de tal forma que en funcin de la

uniformidad de las condiciones de produccin, el periodo de tiempo ser mayor o menor. Cuanto

ms uniforme, el lote incluir una cantidad de alimento elaborada en un mayor intervalo de tiempo.

Una partida puede contener cierto nmero de lotes, siendo conveniente, si es posible, la toma de

muestras de cada lote y su anlisis independiente de los otros. De esta forma se garantiza la

seguridad y se minimiza la magnitud de cualquier rechazo si el anlisis indica que el lote no es

aceptable. Si se trata de una partida grande no separable en lotes se debe establecer el nmero de

unidades de muestra de la misma, que habra que analizar considerndola como un lote. Si son

partidas pequeas, no identificables por nmero de lote alguno, pueden tratarse como lotes

individuales.


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Es importante tambin, a la hora de tomar la muestra, tener en cuenta de qu tipo de

alimento se trata y cmo est envasado. El lote puede estar formado por un gran nmero de

pequeos envases, cajas, sacos, barriles etc., o puede ser un producto a granel que puede

corresponder a una o ms cargas de furgn o vagn.

Un concepto tambin importante es el de marco frente al de partida. No siempre va a ser posible tomar una m muestra aleatoria de cualquier parte de una partida completa, sino slo de

alguna parte accesible de ella. Dicha parte se llama marco, y es de ste de donde se eligen aleatoriamente las muestras. Los resultados finales obtenidos se aplicarn, en este caso, slo a la

fraccin de partida o marco analizado, no a la partida completa.

A la hora de realizar un muestreo es importante el conocimiento de estos datos, y se debe

previamente:

1. Establecer un sistema de eleccin de las unidades de muestra, es decir la forma en que se elige el material a analizar a partir de la totalidad del lote o partida, para que sea ms

representativa.

2. Establecer un programa de muestreo que incluye tanto la forma en la que se va a realizar el muestreo, como el criterio de decisin respecto a rechazar o no el producto en funcin de

los resultados obtenidos.

3. Establecer la tcnica que se va a seguir para la recogida de las unidades de muestra.

De las tcnicas de toma de muestra citadas estudiaremos aspectos referidos a microbiologa

de alimentos y tambin referidos a microbiologa clnica. Adems, estudiaremos algunos aspectos

generales referentes a la preparacin de reactivos y colorantes.

2.PRINCIPIOS GENERALES PARA LA OBTENCIN DE TOMA DE

MUESTRA

2.1 Nmero de unidades de la muestra:

Lo primero que se debe determinar es el nmero de unidades de muestra que es necesario

analizar, y cmo elegirlas al azar, para obtener una muestra representativa del lote.

Entendemos por una muestra representativa aqulla cuyas caractersticas son lo ms posible

similares a las del lote del que procede. Obviamente, el nmero de unidades de muestra que se debe

tomar est relacionado con la precisin que se desee obtener en los resultados.

Se suele sugerir que el nmero de unidades de muestras se corresponda con la raz cuadrada

del nmero total de unidades constituyentes del lote. Otra posibilidad, teniendo en cuenta el

volumen del lote, es tomar el 1% del total cuando el lote es muy grande y el 10% cuando el lote es

pequeo. Estos sistemas citados son aplicables a lotes procedentes de industrias cuyo control se

desconoce. Si se trata de productos sometidos a un control regular, es suficiente analizar 5-10

muestras de cada lote.

Si se trata de lquidos a granel que pueden mezclarse bien, puede bastar una sola muestra.

2.2 Concepto de muestra nica. Hemos hablado de muestras representativas elegidas mediante un muestreo. Estas muestras

son las tomadas con mayor frecuencia en microbiologa alimentaria y con muy poca frecuencia en

sanidad humana. Sin embargo, en otras situaciones no se hace un muestreo sino que se trabaja con

muestra nica: esto significa que es una muestra no tomada de un lote, sino que por s sola


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representa al paciente o al material analizado. Las muestras nicas en muchos casos son

irreemplazables y entonces hay que tratarlas con un cuidado especial porque su prdida o deterioro

puede suponer un problema serio. Las muestras nicas en microbiologa de alimentos normalmente son de lquidos a granel

bien mezclados, aunque hay situaciones menos frecuentes como un bote de conservas a medio

consumir por una persona que ha tenido que ser hospitalizada poco despus. Esta muestra es

irreemplazable (no se puede sustituir por otra).

Las muestras nicas son muy frecuentes en usos clnicos: a un paciente se le toma

normalmente una sola muestra de sangre, orina, etc., para cada tipo de anlisis. Si la muestra se

pierde o se estropea (tubo roto, etc.) a veces podra tomarse otras muestra, pero estas muestras

deben tratarse como si fuesen irreemplazables por las molestias que supone para el paciente

(desplazamientos, un nuevo pinchazo a un beb para extraerle sangre, etc.).

2.3 Sistema de eleccin de las unidades de muestra

La eleccin de las muestras se realiza siguiendo el mtodo del muestreo aleatorio, ya que elimina las posibles subjetividades que pueden surgir en la eleccin de las mismas. Segn este

mtodo, las unidades de la muestra poblacional, ya sean cajas, contenedores, masas de slidos o

volmenes lquidos, se obtienen mediante el uso de los nmeros aleatorios de muestreo. Este mtodo no garantiza que la muestra elegida tenga idnticas caractersticas a las del lote, pero s

asegura que la muestra haya sido elegida de una forma objetiva.

Consiste en separar del lote un nmero de muestras calculado previamente, utilizando una

tabla de nmeros generados al azar: Una vez establecido el nmero de muestras que se deben tomar

del lote, se numeran ordenadamente cada uno de los paquetes, contenedores o unidades del

producto por muestrear, se elige un nmero de la tabla al azar y a partir del mismo se toman las

unidades de muestras numeradas con los mismos nmeros que aparecen a continuacin del primero

elegido.

En ocasiones, no slo se puede sino que adems se debe utilizar un proceso de

estratificacin del muestreo aleatorio: el lote puede venir almacenado en diferentes cajas, o vagones, o bodegas de un barco, donde posiblemente han estado sometidos a diferentes

condiciones ambientales, o se puede saber que la partida que se analiza est compuesta por varios

lotes que representan, por ejemplo, diferentes das de produccin de la misma planta o de diferentes

plantas de la compaa. El objetivo de la estratificacin es dar a cada pequea parte del material de

cada estrato, la misma oportunidad de estar en la muestra total, el obtener muestras al azar de un

nmero dada de alcuotas a partir de cada estrato (cajas, vagones, bodegas, etc.) o de un nmero

elegido de tales sublotes o cajas. Al final, los resultados de los distintos estratos se valoran

separadamente y despus se juntan si resultan homogneos.

Un factor anlogo a la estratificacin dentro de una partida o lote es la heterogeneidad dentro de las unidades de muestra. Con este concepto se pretende considerar el hecho de que en

algunos productos alimenticios existen zonas con distinta calidad dentro de las unidades de muestra.

El nmero de unidades de muestra que se van a analizar, el mtodo exacto por el cual se

debe de obtener la muestra y el sistema de muestreo, se determinar segn diferentes factores como

son:

Peligrosidad: referida a la posibilidad de que ese alimento transmita microorganismos patgenos y gravedad clnica y epidemiolgica de esos patgenos.

Uniformidad: esta caracterstica, que indica que todo el alimento es homogneo existiendo una mezcla perfecta del mismo, permite disminuir el nmero de unidades de muestra a

analizar. La ausencia de esa uniformidad requiere un mayor nmero de unidades de muestra.


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Estratificacin: como ya se ha indicado, en el caso de que esta exista, debe tenerse en cuenta.

Historial: si el suministrador de un alimento tiene un buen historial se puede disminuir el nmero de muestras, mientras que si es malo, es conveniente aumentarlo.

Limitaciones prcticas: la falta de los recursos econmicos necesarios obliga en muchas ocasiones a reducir los programas de muestreo

1. TOMA DE MUESTRA El objetivo del muestreo es obtener una muestra representativa del alimento de tal forma que

al analizarla ofrezca resultados fiables sobre su estado higinico-sanitario. Es evidente, por tanto,

que el producto debe reunir, en el momento de su anlisis, las mismas caractersticas

microbiolgicas que tena al ser tomada la muestra. Es por ello necesario seguir una serie de pautas

con objeto de conseguir la muestra idnea.

3.1 Condiciones que debe cumplir el operador para realizar una toma de muestras adecuada son:

1. Poseer unos conocimientos microbiolgicos generales y usar estos conocimientos aplicando el sentido comn, y

2. Conocer las caractersticas fsico-qumicas y microbiolgicas del material que se va a analizar.

3.2 Precauciones que deben tenerse en cuenta al realizar la toma de muestra se resumen en:

La muestra debe ser representativa del alimento que se analiza o, en muestras clnicas, de la enfermedad estudiada. Veamos un ejemplo: si un paciente presenta lesiones en la piel

que indican que probablemente sufra un infeccin por hongos dermatofitos, una toma de

muestra adecuada consiste en realizar un raspado para obtener escamas de la piel lesionada

donde puede haber micelio y esporas del hongo que pueden ser cultivadas para identificarlo.

Es absurdo en este caso hacer una extraccin de sangre porque esta muestra no es

representativa de una micosis cutnea.

La cantidad de muestra tomada debe ser suficiente para realizar todo el proceso analtico. Para alimentos generalmente se toman unos 100 gramos, aunque las muestras clnicas son mucho menores. Adems, es conveniente tomar al menos el doble de la cantidad

mnima para tener una reserva de muestra en previsin de algn error que pueda obligar a

repetir el anlisis. Por consiguiente, habra que tomar unos 200g de muestra de un alimento.

Las operaciones de toma de muestra deben preservar la identidad de la misma. Esto significa que deben evitarse contaminaciones de la muestra, lo que obliga a trabajar con

instrumentos y recipientes estriles.

Esto tambin obliga a tomar precauciones especiales cuando se investigan microorganismos

anaerobios muy sensibles al oxgeno del aire.

3.3 Material utilizado en la toma de muestras

Se incluyen los envases para la toma de muestra los cualesdebern:


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Estar limpios, secos y estriles.

Tener un tamao que guarde relacin con la muestra que se vaya a tomar.

Ser hermticos e inaccesibles a cualquier contaminacin posterior a su esterilizacin.

Los instrumentos para la apertura de envases son muy variados (tijeras, cuchillos, sacabocados) deben de estar limpios y estriles.

Puede ser necesario llevar alcohol etlico al 70% como desinfectante. Algodn hidrfilo. Etiquetas y material para marcar Equipos de refrigeracin para el transporte. Termmetros que marquen entre 20 y 100C.

3.4 Condiciones a tener en cuenta cuando se realiza el muestreo Si es posible, las unidades de muestra se tomarn en sus envases originales.

En el caso de que los envases sean muy grandes y difciles de transportar, se

tomarn, aspticamente, muestras representativas que pasarn a envases estriles ms

pequeos.

Cuando se trata de alimentos a granel, el muestreo se realiza tomando porciones de

distintas zonas con material estril y pasndolas, aspticamente, a envases esterilizados.

En el caso de que el alimento a muestrear tenga salida por un conducto, se debe tomar

la precaucin de desechar las primeras porciones antes de empezar a tomar la muestra.

En el caso de productos lquidos envasados, se agitarn en su envase y se pasarn

aspticamente a recipientes estriles.

En el caso de que la muestra sea de agua de un grifo, se debe desinfectar ste con

alcohol. Luego se abre y se desecha el agua que sale en las primeras porciones. Se cierra de

nuevo el grifo y se flamea la gota que queda pendiente hasta que emita vapores. A

continuacin se vuelve a abrir el grifo dejando fluir el agua durante 1-2 minutos antes de

recogerla en un recipiente estril. Este se cerrar convenientemente en condiciones de

asepsia.

Para los productos slidos (queso, jamn cocido, productos congelados y similares) se

tomarn las muestras en varias zonas incluyendo la parte profunda con sacabocados,

taladros, sierras, etc., estriles. Las muestras se introducirn, aspticamente, en recipientes

estriles.

Es conveniente anotar la temperatura de almacenamiento del producto e incluso su propia

temperatura. Estos datos se remitirn al laboratorio.

Hay que recordar que en muchas ocasiones las muestras que se deben recoger son nicas,

como cuando se trata de toxiinfeccin alimentaria.


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4. IDENTIFICACIN DE LAS MUESTRAS

Las muestras recin tomadas deben ser identificadas adecuadamente y de modo inmediato.

Debe hacerse constar, en muestras clnicas, el nombre del paciente, el lugar de procedencia de la muestra, el nombre del mdico que la ha pedido, la fecha, a veces

la hora y el tipo de muestra.

En muestras de alimentos se anotar el tipo de muestra, la fecha, el nmero de lote, el lugar de procedencia y otros datos que puedan ser interesantes en cada caso:

temperatura de almacenamiento del alimento, mtodo de muestreo, precauciones

para el transporte de la muestra, etc.

Estos datos se anotarn en etiquetas adhesivas que no puedan despegarse o rotuladas sobre el

envase de modo que no pueda borrarse accidentalmente. Adems, las anotaciones deben ser

perfectamente legibles sin que haya posibilidad de confusin. Cualquier muestra inadecuadamente

identificada debe ser devuelta a su lugar de procedencia con la anotacin ilegible o identificacin inadecuada.

Cuando las muestras sean restos de alimentos sospechosos de una toxiinfeccin

alimentaria, es imprescindible remitir, junto a ellas, un informe donde se incluyan los

datos referentes a la sintomatologa de la enfermedad, epidemiologa del caso, etc.

Nunca se insistir lo bastante en la importancia de una adecuada identificacin de las muestras. Los

errores en la identificacin de las muestras son una de las principales causas de resultados errneos

en el laboratorio de microbiologa. La identificacin de las muestras debe considerarse

responsabilidad del laboratorio.

5. PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA SU ENVO AL LABORATORIO

Las muestras, debidamente preparadas, etiquetadas e informadas, se precintarn, de tal

forma que, para abrirlas sea preciso romper el precinto

6. TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE MUESTRAS.

El adecuado transporte y conservacin de las muestras se consigue cumpliendo una serie de

requisitos:

a) El intervalo de tiempo transcurrido entre la toma de muestra y el comienzo del anlisis en el laboratorio debe ser lo ms corto posible. Esta es la regla de oro.

b) Deben seguirse todas las precauciones necesarias para preservar la representatividad de la muestra.

Esto significa que:


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deben evitarse contaminaciones de las muestras durante su transporte y almacenamiento;

deben evitarse sobrecrecimientos de microorganismos; esto es especialmente importante en aquellas muestras destinadas a realizar

recuentos de grmenes (orina, agua, leche, etc.). La refrigeracin es

un mtodo til, pero slo por tiempo limitado (6 horas para las

orinas).

c) Deben conocerse las caractersticas de la muestra para evitar su transporte y conservacin inadecuadas (la refrigeracin es imprescindible para la orina, pero destruye los

gonococos o meningococos de una muestra en la que se quiere investigar la presencia de

estas bacterias).

d) Existen medios de transporte y conservacin para determinadas muestras clnicas (medios de Amies, Stuart, Cary-Blair, etc.).

TOMA DE MUESTRAS DE LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS

A modo de ejemplo se van a indicar las instrucciones generales de carcter tcnico para

muestrear este tipo de productos.

MATERIALES

Todos los materiales utilizados para la toma de muestras debern ser estriles, estar secos y

limpios y reunir las caractersticas establecidas para cada tipo de producto.

RECIPIENTES

Para las muestras de productos lquidos, debern ser de material apropiado, impermeable al

agua y a las grasas (vidrio, acero inoxidable, plstico especialmente acondicionado), estril o que

permita su esterilizacin, y de forma y capacidad adecuadas. Tales recipientes debern estar secos y

limpios y se podrn cerrar hermticamente. Podrn utilizarse tambin bolsas de plstico adecuadas.

Los recipientes para las muestras de productos slidos o semislidos sern cilndricos, de

boca ancha y debern reunir todas las condiciones anteriores. Tambin se podrn utilizar bolsas de

plstico adecuadas. En el caso de pequeos envases para la venta al pblico, servir como muestra

el contenido de dichos recipientes intactos y cerrados (se consideran envases pequeos aquellos

cuya capacidad sea inferior a 2 litros).

TCNICA PARA LA TOMA DE MUESTRAS:

Se analiza a continuacin cada caso, segn el tipo de producto a analizar.

Leches natural, certificada, higienizada y esterilizada (estado lquido)

a) Materiales:

- Agitadores o mbolos para la mezcla de los lquidos a granel.


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Tales instrumentos debern tener una superficie suficiente para provocar una buena

agitacin del producto y ser lo bastante ligeros en peso para que el operador pueda

moverlos rpidamente en el lquido. Generalmente lo ms apropiado es un agitador

metlico de paletas anchas, provisto en su base de un gran disco perforado, y de

suficiente longitud para llegar al fondo del recipiente (Figura siguiente).

Para el mezclar el contenido de recipientes de gran, tamao se aconseja la agitacin

por medios mecnicos.

- Cacillo de tamao adecuado para recoger la muestra (Fig 2).

b) Tcnica:

- Mezclar perfectamente el lquido. - Tomar la muestra con el cacillo. El volumen mnimo ser de 250 ml.

Leches concentrada, evaporada y condensada (estado semislido)

a) Materiales:

Agitador para el caso de recipientes (cntaras, bidones...)

que contengan el producto a granel. Generalmente lo mas apropiado

es un agitador metlico de paletas anchas (Fig 3).

Los recipientes para la muestras debern ser de boca ancha y

sus tapas cerrar hermticamente.

En el caso de tratarse de pequeos envases para la venta al

pblico, la muestra consistir en uno de tales envases, intacto sin

abrir, y si es posible con la identificacin del fabricante.

b) Tcnica:

El agitador se utilizar para desprender el producto que se ha a adherido a las paredes y al

fondo del recipiente (figura 3) y para mezclar cuidadosamente el contenido de este ltimo. Se

pasarn de dos a tres litros del producto bien mezclado a un recipiente ms pequeo. En ste se

repetir la operacin de agitacin y se tomar una muestra de 200 g por lo menos. En el caso de

pequeos envases para la venta al pblico, el que sirva de muestra no deber abrirse hasta

inmediatamente antes de proceder al anlisis.


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Toma de muestras de la leche en polvo. (Slidos pulverulentos)

a) Materiales:

La toma de muestras se efectuar con una sonda limpia y seca de acero inoxidable, aluminio

o aleacin de aluminio, como la que se muestra en la figura siguiente.

b) Recipientes:

Las muestras se trasvasarn a recipientes limpios y secos, provistos de cierre hermtico, que

sern opacos cuando el tipo de anlisis as lo exija. Las dimensiones del recipiente sern lo

suficientemente amplias para permitir la mezcla del contenido por medio de sacudidas.

c) Tcnica:

La sonda se introducir en el polvo a una velocidad constante de penetracin.

Cuando el tubo de la sonda llegue al fondo del envase se retirar y su contenido se vaciar

inmediatamente en el recipiente destinado a la muestra.

No deber tocarse el polvo con los dedos.

Se realizar uno o varios sondeos para obtener un peso de muestra total de 300 a 500g.

Toma de muestras de queso (slidos)

Dependiendo del peso, forma y tipo de queso:

a) Toma de muestras mediante el corte de un sector. b) Toma de muestras con un sacabocados o sonda adecuada. c) La muestra la constituye un queso entero o una parte sustancial del mismo.

Inmediatamente despus del muestreo, las muestras han de colocarse en un recipiente estril

de tamao y forma adecuadas, y ste se sella y se etiqueta adecuadamente de forma que se eviten

confusiones, prdidas etc. Especialmente importante es este punto cuando se trata de inspeccin

sanitaria de productos o lugares de trabajo o muestras nicas.

CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS

A algunas muestras, por ejemplo de productos lcteos lquidos, destinadas a anlisis

qumicos y microbiolgicos, podr aadrseles una sustancia conservadora adecuada. Dichos

conservadores no afectarn al anlisis subsiguiente o, en todo caso, deber poder determinarse el

valor exacto con el que inciden en los resultados para realizar las correcciones necesarias.

No se aadirn sustancias conservadoras a las muestras ms inertes, tales como los

productos lcteos slidos, semislidos o desecados. Dichas muestras se enfriarn rpidamente y se

conservarn en cmara frigorfica a una temperatura entre 0 y 5C hasta su anlisis


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correspondiente, excepto cuando se trate de leches en polvo, que podrn conservarse a temperatura

ambiente.

Aunque la conservacin en fro suele ser lo habitual para la mayora de muestras, hay casos

particulares en que esto no es recomendable, ya que determinada carga bacteriana puede no soportar

esta temperatura, y falsear los resultados ofreciendo datos menores a los reales. Igualmente para

muestras con carga psicrfila especfica, puede interesar conservacin a temperaturas mayores o

menores.

TRANSPORTE

Una vez tomadas, las muestras se llevarn al laboratorio lo antes posible para su anlisis

inmediato.

Durante el transporte se adoptarn las debidas precauciones para evitar que estn expuestas

directamente al sol y, en el caso de productos perecederos, para no ser sometidos a temperaturas

inferiores a 0C ni superiores a 10C.

MUESTREO Y ESTADSTICA

DEFINICIONES DE LOS PRINCIPALES CONCEPTOS DE UN PROCESO DE MUESTREO

Lote: Es un conjunto de unidades de producto del que se extrae una muestra para realizar una inspeccin. Tambin se llama poblacin.

Tamao del lote (N): nmero de unidades de producto de que consta el lote.

Muestra: Conjunto de una o varias unidades de producto (n) extrada al azar de un lote, o parte de ste.

Muestreo: Accin que consiste en tomar una muestra de un lote.

Niveles de inspeccin: determinan la relacin que guardan el tamao del lote y el tamao de la muestra. Existen normalmente tres niveles de inspeccin, y a mayor nivel, ms grande es la muestra en relacin al lote. Se considera el nivel II el normal y el I de confianza.

Planes de muestreo: conjunto de normas dnde se indica el nmero de unidades de producto de cada lote que debern ser inspeccionadas, as como el criterio para aceptar o rechazar el lote en base a la informacin derivada de la inspeccin de las unidades muestreadas.

Estadstica: es la ciencia que estudia los fenmenos aleatorios. Proporciona herramientas muy potentes para analizar conjuntos de datos y la relacin existente entre ellos. Trata de sacar conclusiones de una poblacin a partir de muestras tomadas en la misma.

PLANTEAMIENTO DE LA TOMA DE MUESTRAS

La toma de muestras sirve, por lo tanto, para conocer informacin del estado de una caracterstica en una poblacin (lote) mediante el examen de una porcin (muestra)


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de la misma. El muestreo es ms econmico y rpido para lotes de gran tamao y es imprescindible en el caso de que el anlisis que se realice al producto sea destructivo. La inspeccin total sera el examen de todos los individuos de una poblacin y slo se realiza para casos en que el anlisis no sea destructivo, el lote sea muy pequeo y/o no se tolere ningn defecto.

Ventajas del anlisis de muestras, frente a toda la poblacin:

- Ventajas econmicas (es ms barato); - Menor necesidad de personal; - La informacin se obtiene con mayor rapidez. - No se destruye completamente el lote en caso de anlisis destructivos.

Inconvenientes:

- Hay riesgos que hay que manejar (dar como buenos lotes que tienen mala calidad y al contrario) y evaluar estadsticamente.

- El proceso conlleva mayor cantidad de documentacin y mayor planificacin. - Da menos informacin el examen de una muestra que el de toda la poblacin.

ETAPAS DEL EXAMEN POR MUESTREO:

1. Identificar la poblacin de la que se ha de obtener la muestra.

2. Obtener la muestra (porcin de la poblacin que se va a examinar). Hay que indicar su tamao y cmo se toma la muestra.

3. Preparar la muestra para el anlisis (puede haber una etapa de conservacin, de trasporte, de reduccin del tamao, etc).

4. Realizar la tcnica analtica completa que nos permita analizar lo que pretendemos.

5. Presentar adecuadamente los resultados (realizar un informe).

FORMA DE REALIZAR EL MUESTREO

Para reducir la variabilidad en la toma de muestras hay que elaborar un plan de muestreo (normas que se establecen para muestrear un lote de un producto indicando el nmero de unidades de cada lote que deben ser inspeccionadas y los criterios para aceptarlo o rechazarlo). Los planes de muestreo que dan mejor resultado son los que se desarrollan aplicando una base estadstica.

TIPOS DE MUESTREO

Para conocer el valor medio de una caracterstica de la poblacin existen bsicamente dos modelos:

Muestreos probabilsticos

Se pretende obtener una muestra representativa de la poblacin aplicando un sistema de seleccin aleatoria de la muestra y mtodos estadsticos y probabilsticos. "Al


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azar" quiere decir que en la operacin de muestreo cada elemento de la poblacin a estudiar tiene la misma posibilidad de ser incluido en la muestra. Tipos:

1.1. Muestreo simple al azar: se usa una tabla de nmeros aleatorios o sistema equivalente para elegir al azar (plantillas, generacin informtica de valores y otros sistemas de patrones para tomas); se escogen las muestras indicadas por la tabla. Por definicin, confiere a cada unidad de la poblacin total N, la misma oportunidad de ser incluido en la muestra n.

1.2. Muestreo estratificado al azar: primero se divide la poblacin en distintos grupos y en cada grupo se hace un muestreo al azar, se toma una submuestra y la muestra final es el resultado de la suma de esas submuestras.

1.3. Muestreo sistemtico: el primer elemento se muestrea al azar entre los K primeros nmeros de una poblacin y, despus, se toma una muestra cada K unidades.

Muestreos no probabilsticos:

No se desea una muestra representativa sino que, en base a la experiencia del muestreador y/o de la utilizacin de la mxima informacin de conocimiento de la poblacin, se selecciona una muestra siguiendo un criterio personal o de conveniencia. En este caso alguno de los elementos tienen probabilidad nula de ser seleccionados. No se puede predecir el error aleatorio cometido. Sin embargo a veces es obligado este tipo de muestreo debido a costes, conveniencia, accesibilidad, etc. Ej, toma de muestras biolgicas para anlisis clnicos; bsqueda de la fuente de una toxiinfeccin alimentaria; etc

EN BASE A LA NATURALEZA DE LA POBLACIN OBJETO DEL ESTUDIO

Productos que se producen en unidades repetidas

Los datos primarios a tener en cuenta a la hora de elaborar el plan de muestreo son:

- Nmero de unidades que componen el total de la partida o lote (N). - Nmero de unidades que tendrn que componer la muestra (n). - Valor lmite de unidades defectuosas a encontrar en la muestra para considerar

aceptable la partida. Este valor depende del nivel de calidad microbiolgica que deba satisfacer el lote.

Dentro de este grupo se utilizan dos tipos de planes de muestreo: 1. Planes de muestreo por atributos:

Lo que se hace sobre la muestra es contabilizar uno o una serie de defectos. Es la ms usada en anlisis microbiolgicos. Se toma una muestra compuesta de varias unidades y cada unidad se clasifica como conforme o no conforme. El nmero de disconformidades (nmero de unidades no conformes) se compara con un nmero de aceptacin, que refleja el objetivo de calidad del lote respecto a una caracterstica, a partir del cual se toma la decisin de aceptar o no el lote. Hay que manejar una serie de riesgos para decidir los objetivos de calidad. Es muy utilizado en microbiologa.

2. Planes de muestreo basados en variables:


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Sobre la muestra se mide una variable fsica continua. En las submuestras se mide dicha variable y se calcula la media, que ser lo que se compara con el criterio de calidad o aceptacin. Son similares a los planes de muestreo por atributos en cuanto a que un lote se acepta o se rechaza en funcin de los resultados obtenidos en una muestra tomada de ese lote. Sin embargo, en este caso la caracterstica es medible, por lo que el resultado es una medida, que la podemos indicar como un valor medio de las unidades que componen la muestra, una variabilidad, etc.

Productos de gran tamao:

Para ellos no es posible aplicar un mtodo analtico en la totalidad del producto (excepto para gases en algunos casos). Se emplean los llamados muestreos por volumen y hay que tomar una serie de decisiones: cuntas porciones se van a tomar, con qu utensilios se van a tomar y cmo reducir el gran volumen que tomamos a un tamao de muestra razonable para ser analizada en el laboratorio.

1. Productos slidos de gran tamao: pueden ser muy heterogneos y difciles de homogeneizar.

2. Productos lquidos y gases de gran tamao: Son ms susceptibles que los anteriores de tener caractersticas ms uniformes en todo el producto.

Para slidos y lquidos, el anlisis debe realizarse sobre una parte de la partida. Si la partida es grande y repartida entre varios contenedores, el muestreo tendr que contemplar el conjunto de subunidades de que consta la partida total. El plan de muestreo deber indicar como mnimo:

- Nmero de unidades a muestrear, segn la composicin del total de la partida (sacos, bidones, cajas, etc.).

- Forma de muestrear cada subunidad (cmo y cunto). - Cmo mezclar las muestras de las subunidades para configurar la muestra (o

muestras) que se van a remitir al laboratorio.

PLANES DE MUESTREO UTILIZADOS EN MICROBIOLOGA DE LOS ALIMENTOS

Se trata de planes de muestreo por atributos, que se pueden clasificar en dos tipos:

De dos atributos (clases o categoras):

Se decide el nmero de muestras que se toman y el nmero mximo de unidades defectuosas permitidas. Se califica cada muestra como buena o mala y analizando el resultado total se clasificar todo el lote. Se utilizan:

Un valor microbiolgico de referencia (m): cada muestra es

catalogada como buena o mala en funcin de que tenga una carga

microbiana mayor o menor que m:

carga m: aceptable carga > m: inaceptable o defectuosa


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Un nmero mximo de unidades de muestra defectuosa (c): relacin

con la calidad microbiolgica del lote.

Un nmero de unidades de que se compone la muestra: n

Se clasifica el lote en dos categoras:

a) INSATISFACTORIO. Si el nmero de muestras (n) con una carga microbiana

mayor que m es mayor que c, entonces se concluye que el lote es de mala calidad microbiolgica.

b) SATISFACTORIO. Si el nmero de muestras con una carga microbiana mayor que m es menor o igual que c, entonces se concluye que el lote es de buena calidad microbiolgica.

Para alimentos y productos asimilados, segn sus normas microbiolgicas, el valor microbiolgico de referencia (m) puede ser ausencia de la bacteria en una determinada cantidad de muestra. En este caso m=0. Ej: para helados sin ningn componente lcteo se encuentra en el RD 618/1998 y CE 2073/2004:

De tres atributos:

Se utilizan: Un valor umbral del nmero de bacterias: m

Un valor de carga microbiana mayor: M

Un nmero de unidades de que se compone la muestra: n

Un nmero de unidades de la muestra cuyo nmero de bacterias

podr situarse entre m y M: c (en relacin con la calidad del lote).

Clasifican a las muestras en tres categoras:

Menor que m: aceptable

Entre m y M: marginalmente aceptable

Mayor que M: defectuosa

Analizando estos resultados para las muestras, se clasificar al lote en TRES categoras: buena, aceptable o mala calidad microbiolgica. Ms concretamente:

SATISFACTORIO, si todas las muestras son (menor o igual) que m.

ACEPTABLE, si un mximo de c/n (c de cada n) valores se encuentran entre

m y M y el resto de los valores observados son m.

INSATISFACTORIO, si uno o varios valores observados son > M o ms de

c/n valores se encuentran entre m y M.


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El Reglamento CE 2073/2004 define cumplimiento de los criterios microbiolgicos como la obtencin de resultados satisfactorios o aceptables, segn lo establecido, al efectuar pruebas comparando con los valores fijados para los criterios, mediante la toma de muestras, la realizacin de anlisis y la aplicacin de acciones correctoras, de conformidad con la legislacin alimentaria y las instrucciones de la autoridad competente. Ej: para helados sin ningn componente lcteo se encuentra en el RD 618/1998 (igual que el ejemplo anterior) se tiene con respecto a estos otros parmetros:

Ejemplos: La normativa espaola establece lmites microbiolgicos para los distintos productos alimenticios. Por ejemplo, en el caso de la leche en polvo se establecen, entre otros, los siguientes lmites (recogidos en el RD 1649/94 y en el RD 402/96): - Coliformes: (Ej de 3 atributos) n (nmero de muestras a analizar) = 5 c=2 M = 10 UFC/g m = 0 UFC/g Lo que quiere decir que:

- Si el recuento de una muestra supera el valor 10 UFC/g, el lote al que representa se declara inaceptable, desde el punto de vista de la higiene alimentaria.

- El nmero de muestras que presenten un recuento entre 0 UFC/g y 10 UFC/g no puede ser superior a 2, de lo contrario el lote se declara inaceptable.

- Si hubiera 2 o menos muestras con carga entre 0 y 10 UFC/g, estas muestras seran marginalmente aceptables, luego el lote se acepta (aceptable).

- Sin para n=5 todas muestran ausencia de crecimiento de coliformes (m=0 UFC/g) el lote se declarara SATISFACTORIO.


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- Salmonella n=10 c=0 Ausencia en 25 g Lo que quiere decir que tras el anlisis de 10 muestras de 25 g cada una, no debe encontrarse presencia de Salmonella en ninguna. Si se encontrase una muestra con presencia de esta bacteria, es INACEPTABLE, se considera contaminado todo el lote y debe rechazarse.


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7. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANLISIS.

Hay muestras que pueden ser cultivadas o sometidas a pruebas de identificacin tal y como

se reciben en el laboratorio.

Sin embargo, muchas otras deben ser preparadas (modificadas) antes del anlisis microbiolgico. Esto sucede cuando se presenta una de estas situaciones:

a) La muestra contiene gran cantidad de flora que acompaa al microorganismo buscado y puede interferir en los anlisis: entonces hay que descontaminar la muestra o enriquecerla

.

b) La muestra es slida o pastosa y se hace necesario licuarla.

c) La muestra contiene una elevada carga de bacterias y hay que diluirla.

A continuacin estudiaremos las tcnicas utilizadas en cada una de estas situaciones, pero

antes tenemos que advertir que en las operaciones de preparacin de muestras hay que

guardar todas las reglas de asepsia que permitan evitar la contaminacin de la muestra.

7.1. Preparacin de una muestra con exceso de flora acompaante.

En determinadas muestras puede recurrirse a un procedimiento de enriquecimiento selectivo. Esto suele hacerse mediante cultivo en medios de enriquecimiento selectivo. Una situacin muy frecuente es la investigacin de

Salmonella en presencia de una gran cantidad de otras enterobacterias acompaantes,

ya sea en muestras de heces humanas o en alimentos. Se recurre entonces a un

enriquecimiento selectivo mediante cultivo en caldo selenito.

A veces se considera que este procedimiento no forma parte de la preparacin de la

muestra, sino de del anlisis en s mismo.

Otras muestras se someten a procedimientos de descontaminacin en los que se matan selectivamente los microorganismos que pueden interferir y se dejan

sobrevivir los buscados. Las muestras de esputo se descontaminan antes de

cultivarlas para investigar micobacterias.

7.2. Muestras slidas o pastosas que es necesario licuar.

Esta situacin es poco frecuente en muestras clnicas, pero en el anlisis microbiolgico de

alimentos slidos o de elevada viscosidad es necesario transformar la muestra en una suspensin lquida que contenga los microorganismos repartidos de forma homognea. Esto se consigue agregando un volumen medido de diluyente estril a una cantidad pesada de

muestra slida y utilizando despus algn procedimiento de trituracin y homogeneizacn.

A continuacin estudiaremos distintos aspectos de esta tcnica.


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1.-Separacin de la muestra analtica.

Llamamos muestra analtica a la porcin de la muestra total que va a ser usada en el

anlisis. El resto de la muestra, utilizada como reserva, no es muestra analtica.

La cantidad de muestra analtica tomada para homogeneizarla debe ser suficientemente

grande como para que sea representativa, como ya se mencion antes. A veces es suficiente

con homogeneizar unos 10 gramos, pero como regla general homogeneizaremos la mayor

cantidad que permita nuestra tcnica de homogeneizacin (100 gramos suele ser una

cantidad ptima); de esta forma, la representatividad de la muestras ser lo ms elevada

posible. En otras situaciones la cantidad de muestra a homogeneizar est establecida por la

legislacin sanitaria.

Cuando el alimento est formando por distintos componentes (por ejemplo: una lata de

cocido que contiene garbanzos, caldo y trozos de carne), la muestra analtica debe contener todos

los componentes de la muestra completa y adems mantener las mismas proporciones.

2.-Pesada de la muestra.

Se har en condiciones aspticas. Puede operarse de dos formas:

a) Se pesa la cantidad exacta de muestra y despus se agrega un volumen previamente

medido de diluyente.

b) Cuando resulta difcil pesar una cantidad exacta de muestra, se pesa una cantidad

aproximada y despus se mide el diluyente necesario en una probeta estril.

3.-Diluyente.

La principal caracterstica que debe tener un diluyente es no producir modificaciones

cualitativas ni cuantitativas en la flora de la muestra, es decir, debe mantener lo ms fielmente

posible a la flora de la muestra sin suprimirla ni favorecer su desarrollo. En microbiologa

alimentaria se utilizan varios diluyentes. Entre los ms usados se encuentran:

a. agua de triptona con sal. b. disolucin de Ringer . c. agua de peptona tamponada.

El mismo diluyente empleado en preparar la suspensin madre es el empleado en preparar la

serie de diluciones decimales.

4.-Trituracin y homogeneizacin de la muestra.

En el triturado hay que evitar la destruccin de los grmenes por rotura de su membrana o

por calentamiento excesivo. Adems de la perfecta trituracin de la muestra es necesario

obtener una mezcla homognea que tenga una distribucin uniforme de los grmenes y de

sus toxinas.

Hay varios tipos de trituradores y dentro de cada tipo puede haberlos de capacidades diversas:


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Homogenizadores de jarra: consisten en un vaso de vidrio o acero con una hlice en su base que funciona cuando se acopla a un motor.

Homogeneizadores de vstago con hlice: el vstago se introduce en un vaso con la mezcla que se va a homogeneizar. Funciona como una batidora clsica de cocina.

Estos dos tipos de homogenizadores tienen el inconveniente de que necesitan una limpieza

exhaustiva y una esterilizacin antes de cada homogeneizacin. Esto supone un engorro. Otro

inconveniente es que producen aerosoles que pueden contener microorganismos patgenos. Los

inconvenientes de estos homogenizadores no estn presentes en los:

Homogeneizadores de paletas: la mezcla de muestra y diluyente se introduce en una bolsa de plstico estril. Esta bolsa se sita en el homogeneizador, que est provisto de paletas que

golpean rtmicamente la bolsa. Esto dislacera el alimento y pone los grmenes en

suspensin. Para homogeneizar una nueva muestra no hay que limpiar nada: se utiliza una

nueva bolsa. Modelos comerciales conocidos son: Stomacher y Masticator.

En la homogeneizacin de alimentos slidos es frecuente que la suspensin se prepare al 10%

peso/volumen. De este modo, la cantidad de alimento pesada expresada en gramos se multiplica por

9 y el nmero obtenido es el volumen en centmetros cbicos de diluyente a agregar. A la

suspensin obtenida se le llama suspensin madre, dilucin 1/10 o dilucin -1, porque:1/10=10-1

Las muestras de alimentos lquidos no es necesario licuarlas, pero puede ser necesario

homogeneizarlas. Esto puede conseguirse simplemente agitando bien el envase antes de abrirlo.

7.3.-Muestras con una elevada carga bacteriana.

Las muestras con una carga bacteriana elevada no deben cultivarse directamente, pues las

colonias de bacterias creceran demasiado juntas. Es necesario entonces diluir la muestra.

El procedimiento de dilucin depende de los fines perseguidos.

7.3.1.-Diluciones decimales seriadas.

Se hacen para realizar recuentos microbianos. Una serie de diluciones decimales suele preparase

as:

a) La muestra se homogeneiza al 10% (p/v), obtenindose la dilucin -1. b) A un tubo que contenga 9 cc de diluyente estril se le agrega 1 cc de la dilucin -1. Tras

mezclar muy bien se obtiene la dilucin -2 (1/100).

c) Puede obtenerse la dilucin -3 agregando 1 cc de la dilucin -2 a un tubo de ensayo que contenga 9 cc de diluyente y mezclando bien despus.

d) Las diluciones sucesivas que sean necesarias (-4, -5, -6, etc.) se preparan de modo similar.

Hay que tener en cuenta que:

.-Para preparar cada una de las diluciones debe utilizarse una pipeta limpia y estril

..-La serie decimal as preparada debe inocularse en el medio de cultivo de inmediato

o, como mximo, dos horas despus de haberla preparado.

.-Siempre que su uso se retrase ms de 10 minutos deben refrigerarse los tubos.


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De no respetar estas limitaciones probablemente haya crecimiento bacteriano que

invalide las diluciones preparadas.


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7.3.2.-Empleo de la escala de MacFarland.

Para hacer antibiogramas normalmente se realiza una siembra de una placa de agar Meller-

Hinton. El inculo es una suspensin de bacterias preparada resuspendiendo con un asa varias

colonias de cultivo puro en un diluyente contenido en un tubo de ensayo. El diluyente usado suele

ser suero salino. Las colonias que crezcan sobre la placa no deben estar ni muy juntas ni muy

separadas. Para ello, la suspensin de bacterias no debe estar ni muy diluida ni muy concentrada.

Puede prepararse una suspensin de bacterias de concentracin aproximada a la ptima

usando la escala de MacFarland. Esta escala consiste en 11 tubos o ampollas de vidrio numeradas

(n 0.5, 1, 2, , 10). Cada ampolla contiene agua y un precipitado blanco de sulfato de bario. Al agitar la ampolla el BaSO4 se resuspende y enturbia el lquido. Los tubos de la escala tienen una

turbidez que crece con su nmero. Para la preparacin de la suspensin de bacterias se elige el tubo

adecuado de la escala de MacFarland y se agita. Este tubo y el de la suspensin bacteriana se

observan a contraluz o sobre fondo negro y se compara visualmente su turbidez. La suspensin de

bacterias deber diluirse o concentrarse hasta que su turbidez se asemeje a la del tubo de

MacFarland. Este es un mtodo grosero pero cuya precisin es suficiente para la realizacin de

antibiogramas.


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7.3.3.-Otras suspensiones de muestras y colonias bacterianas.

Para obtener aislamientos a partir de material con elevada carga microbiana suele ser suficiente

preparar una suspensin a ojo, sin medios cuantitativos.

Los diluyentes empleados pueden ser:

Suero salino (muy frecuente en muestras clnicas)

agua destilada (poco frecuente)

agua de peptona tamponada.

Para realizar una resiembra puede prepararse una suspensin de bacterias o levaduras tomando

una porcin de colonia con un asa y suspendindola en un pequeo volumen de diluyente estril en

un tubo de ensayo tambin estril. Con la misma asa puede tomarse un muy pequeo volumen de

suspensin para inocular la placa.


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8. PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTES

MICROBIOLGICOS.

La mayora de los reactivos y colorantes normalmente utilizados en microbiologa no

necesitan estar preparados con la exactitud necesaria en las tcnicas de anlisis qumico. Por

consiguiente, en la mayora de los casos es posible evitar el uso de balanzas muy precisas, siendo

suficiente con balanzas cuya precisin sea de +- 0,1 gramos. Tambin se puede prescindir del uso

de matraces aforados, siendo suficiente con la precisin ofrecida por las probetas. Esto supone un

importante ahorro de tiempo y medios materiales.

Muchos de los colorantes utilizados en microbiologa son sustancias cancergenas. Por

consiguiente, el producto puro slido hay que manipularlo con extremo cuidado para evitar

derrames y contactos con la piel o, peor an, con las vas respiratorias. Tambin hay que tener

cuidado con las disoluciones ya preparadas, utilizando guantes y bata en todo momento. El mayor

riesgo lo ofrecen los colorantes puros debido a que estn mucho ms concentrados que sus

disoluciones y debido tambin a que, debido a su preparacin en forma de polvo, existe riesgo de su

inhalacin. Es por esto por lo que en la mayora de los laboratorios microbiolgicos las disoluciones

colorantes se adquieren en el comercio ya preparadas.

5-toma_de_muestra.pdf

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