5. presentacion v
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ALEXIS DUEÑAS DAVILA
En los años 20, el
bioquímico Phoebus
Levene determinó que el
ADN estaba formado por
4 tipos distintos de
nucleótidos.
Cada nucleótido estaba
formado por
desoxirribosa, fosfato y
una base nitrogenada
(A, C, T o G).
En 1949, Erwin Chargaff analizó el
contenido molar de las bases de
ADN procedente de diversos
organismos.
Descurbió que en todos los casos
[A]=[T] y que [G]=[C], o
[A+G]=[T+C]
([purinas]=[pirimidinas]).
Esta es la llamada ley de Chargaff.
A primeros de los años 50Maurice Wilkins y RosalindFranklin realizaron losprimeros estudios físicoscon el ADN mediante latécnica de difracción derayos X y observaron que:
• (1) la molécula de ADN es unacadena extendida con unaestructura altamente ordenada
• (2) la molécula de ADN eshelicoidal y tiene 20 Å de diámetro
• (3) la hélice del ADN estácompuesta por dos hebrashelicoidales y
• (4) las bases de los nucleótidosestán apiladas con los planosseparados por una distancia de 3,4Å.
En 1953, James Watson yFrancis Crick combinaron losdatos químicos y físicos delADN, y propusieron un modeloestructural del ADN.
En este modelo estructural delADN las dos hebras estánenrolladas una alrededor de laotra formando una doble hebrahelicoidal.
Las dos cadenas depolinucleótidos se mantienenequidistantes, al tiempo que seenrollan en torno a un ejeimaginario.
Esta estructura de doblehélice del ADN no es lamás habitual.
En las célulaseucariotas, el ADN seencuentra localizadoprincipalmente en elnúcleo, en forma decromosomas, que soncomplejas asociacionesde ADN y proteínas.
Cuando se calienta unADN de doble hebra(forma nativa) serompen las fuerzas deunión entre las doshebras y acaban porsepararse.
Por tanto, el ADNdesnaturalizado es deuna sola hebra.
La transición entre elestado nativo y eldesnaturalizado seconoce comodesnaturalización.
En determinadascondiciones, una disolución deADN monocatenario(desnaturalizado), puede volvera formar el ADN nativo (dedoble hebra).
Este proceso recibe el nombrede renaturalización del ADN.
Cuando el ADN renaturalizadose forma a partir de moléculasde ADN de distinto origen, oentre una molécula de ADN yotra de ARN, larenaturalización se conocecomo hibridación.
DESNATURALIZACIÓN DEL
ADN
Cuando se rompen lasfuerzas de unión entre lasdos hebras del ADN, éstasacaban por separarse.
Por tanto, el ADNdesnaturalizado es de unasola hebra.
La transición entre elestado nativo y eldesnaturalizado se conocecomo desnaturalización.
La forma más corriente de desnaturalizar el ADN es porcalentamiento.
Otro agente desnaturalizante es el pH elevado porque cambiala carga de algunos grupos que forman parte de los puentesde hidrógeno.
En agua destilada, con una fuerza iónica muy reducida, seproduce la separación de las hebras.
Este fenómeno se debe a que en agua muy pura, la fuerterepulsión entre las cargas negativas de los grupos fosfato noes contrarrestada por los correspondientes contraiones (Na+,Mg+2).
La gráfica que representa la medidade A260 en función de la temperaturase llama curva de fusión del ADN:
1.- La A260 permanece constantehasta temperaturas bien por encimade las fisiológicas. En este intervalo,la molécula está en forma de doblehebra.
2.- El aumento de A260 tiene lugar enun estrecho rango de temperaturas(6-8 ºC), que se inicia cuandocomienzan a romperse las unionesentre las bases en varios segmentosde la molécula.
3.- La A260 máxima esaproximadamente un 37%mayor que el valor inicial, ycorresponde al estado enque las dos hebras estáncompletamente separadas.
Un parámetro muy útil paracaracterizar la evolución dela fusión es la temperaturaa la que el aumento de laA260 ha llegado a la mitad
de su camino.
Esta temperatura sellama temperatura defusión (Tm).
Se ha comprobado quela Tm aumenta con elcontenido de G+C(Figura de la derecha).
Como el par de bases G-C está unido por trespuentes de hidrógeno, serequiere una temperaturamás alta paradesnaturalizarlo.
Los reactivos que incrementanla solubilidad de las bases(como el etanol) disminuyen laTm, ya que reducen lainteracción hidrofóbica que lasmantiene unidas.
Se deduce que tanto lospuentes de hidrógeno como lasinteracciones hidrofóbicascooperan para formar unaestructura estable.
Si se reduce o eliminacualquiera de estasinteracciones, la estabilidaddisminuye y la Tm es menor.
RENATURALIZACIÓN DEL ADN
Una disolución de ADN desnaturalizado puede ser tratada de forma querecupere su configuración nativa.
El proceso se llama renaturalización, y se obtiene un ADN renaturalizado.
Para que tenga lugar la renaturalización deben cumplirse dos requisitos:
La concentración salina debe ser alta ([NaCl] entre 0,15 y 0,5 M) paraeliminar la repulsión entre los grupos fosfato de las dos hebras.
La temperatura deber ser lo suficientemente elevada para romper lospuentes de hidrógeno, y lo suficientemente baja como para estabilizarlos apareamientos correctos entre las bases de hebras distintas.
La temperatura óptima de renaturalización es de unos 20 a 25 ºC pordebajo de la Tm.
La renaturalización es unfenómeno de unión al azar, ypor tanto la molécula de ADNrenaturalizada no contiene lashebras originales.
Si mezclamos un ADN marcadocon el isótopo 15N con otro quecontenga el isótopo normal 14N ylos desnaturalizamos, durante larenaturalización se forman 3tipos de moléculas de doblehebra:
un 25% con 14N en las doshebras,
un 25% con 15N en las doshebras y
un 50% con una hebra 14N y otra15N.
HIBRIDACIÓN DEL ADN
Cuando el ADN renaturalizadose forma a partir de moléculasde ADN de distinto origen larenaturalización se conocecomo hibridación.
Una característica es que nosólo se puede producir entredos ADN distintos, sino tambiénentre ADN y ARN, siempre quesus secuencias de nucleótidosean complementarias
Hasta mediados de losaños 40 había fuertescontroversias sobre lanaturaleza química delmaterial hereditario.
Si alguna biomolécula podíaser candidata a ser elmaterial genético, éstaseran las proteínas con suestructura tan compleja yvariada.
Moléculas tan simples yrepetitivas como los ácidosnucleicos no eran, a priori,candidatos idóneos comoportadores del materialgenético.
En 1928, Frederick Griffithdescribió el llamado fenómenode transformación porneumococos. Se distinguen dostipos de neumococos.
Los neumococos de tipo R(rugoso) forman colonias deaspecto rugoso sobre un mediosólido, y son poco virulentos.
Los neumococos de tipo S (liso)forman colonias aspecto liso ybrillante sobre un medio sólido, yprovocan infecciones letales.
Se caracterizan por poseer unacápsula de polisacáridos en lasuperficie celular.
EL EXPERIMENTO DE HERSHEY Y CHASE
Para poder entender el experimento de Hershey y Chase, quedemostraba que eran las moléculas de ADN y no las proteínas lasportadoras de la información genética.
Es necesario comprender el mecanismo de replicación de losbacteriófagos.
Los bacteriófagos (o fagos)son virus que atacan a lasbacterias.
Los fagos de la serie T-par(T2, T4 y T6) atacan a laEscherichi coli.
Estos fagos constan de unacabeza proteica que guardauna molécula de ADN, unacola y una serie defilamentos.
Cuando estos virusencuentran una bacteriasusceptible, se fijan a unreceptor específico de lasuperficie celular y leinyectan el contenido de lacabeza (el ADN).
En el interior de la bacteria, esteADN crea varios cientos decopias de sí mismo y de lasproteínas que lo componen,aprovechando la maquinariabios-intética de la célula.
Una vez completada la síntesis,las moléculas de ADN y deproteína se ensamblan paraformar nuevas copias del virus.
La bacteria de destruye (lisis) ylos nuevos virus son liberados almedio donde pueden iniciarnuevos ciclos de infección (ciclolítico).
Como los virus de laprogenie heredan loscaracteres fenotípicosdel virus primitivo, AlfredHershey y Martha Chasediseñaron un sistemapara averiguar si laherencia eracomunicada por el ADNo por las proteínas.
Utilizaron técnicas demarcaje radioactivo paraconstruir dos tipos defagos distintos.
Una población de fagoscreció en un medio quecontenía 35S.
El 35S marca a las proteínas quecontienen residuos de Cys o Mety por lo tanto, esta poblacióncontiene proteínas radioactivas yADN no radioactivo, ya que elADN no contiene S.
La segunda población de viruscreció en un medio que contenía32P. El 32P marca los ácidosnucleicos, pero no a lasproteínas, de forma que estapoblación contiene ADNradioactivo y proteínas noradioactivas.
Ambos tipos de virus fueronutilizados por separado parainfectar a células de E. colisusceptibles.
Después de la infección, yantes de que se completarael ciclo lítico sometían a lascélulas a una fuerteagitación mecánica paradesprender de la superficiede la célula a todos los virusque pudiesen estaradheridos,
Luego, por centrifugaciónseparaban las células de laspartículas víricas:
Las células se acumulan enel sedimento, y los fagospermanecen en elsobrenadante.
A continuación medían laradioactividad asociada a lascélulas.
Las células presentabanradioactividad únicamente cuandose hacía el experimento con virus32P.
Cuando se realizaba elexperimento con virus 35S, lascélulas no contenían radioactividad.
Como los virus que surgen deambos ciclos líticos sonabsolutamente normales, esteexperimento indica que lascaracterísticas genéticas del virushan sido comunicadas por el ADN,no por la proteína.