Comparación entre implantación intralesional y perfusión

regional en el tratamiento de células madre mesenquimales en

tendinitis flexoras

Patricia Becerra (1) LV, Miguel A. Valdés* (1) LV, MS, Diplomado ECVS, ACVS,

Francisco Neves (1) LV, Jay Dudhia (2) LV, Neil G. Hartman (3), Andrew Fiske-

Jackson (2) y Roger K.W. Smith (2) MRCVS, PhD, Diplomate ECVS

(1) Hospital de Referencia La Equina, Apdo 110, Camino de Martagina Km 1

29692 – Manilva, Spain

(2) Dept. of Veterinary Clinical Sciences, The Royal Veterinary College, Hawkshead

Lane, North Mymms, Hatfield, Herts. AL9 7TA. United Kingdom

(3) Department of Nuclear Medicine, Barts & The London NHS Trust, West

Smithfield, London EC1A 7BE. United Kingdom

Summary

Mesenchymal stem cells (MSCs) are being used with increasing frequency in soft

tissue injuries but immediate cell survival and alternative administration routes have

not been investigated. We hypothesised that MSCs are retained within the tendon

after intra-lesional injection but can also “home” to injury sites after intravenous

injection or regional perfusion.

Labelling efficiency of MSCs with technetium-99m (Tc-99m) and

hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) was initially determined in vitro. 10

million labelled MSCs were then implanted into 12 horses with naturally-occurring

tendon or ligament injuries intra-lesionally, intravenously, and by regional perfusion

on consecutive weeks. Labelled MSCs were traced over 36 hours using gamma

scintigraphy.

Maximum in vitro cell labelling was 55% with >90% cell viability. In contrast,

labelling efficiencies varied between 2.7% and 22.5% (mean 9.2%) in clinical cases.

Cells were retained in the damaged area after intra-lesional administration but only

~10% of cells were still present within the tendon after 24 hours. After intravenous

injection, cells largely distributed to the lung fields, with no detectable cells in the

tendon lesions. In contrast, significant labelling of the tendon lesions was observed in

11/12 horses following regional perfusion.

Optimal number of cells is not known but the highest cell numbers were retained after

intra-lesional injection, although with considerable cell loss. Regional perfusion

appeared to be a viable alternative if no core lesion was present. The absence of cells

seen after intravenous administration may be a consequence of low labelling

efficiencies, but cells still did not ‘home’ to the lesion in large numbers.

Introducción:

Las células madre mesenquimales (CMM) se usan de manera creciente en el

tratamiento de lesiones tendinosas y ligamentosas tanto de manera experimental (1, 2)

como en estudios clínicos (3). La supervivencia de las CMM implantadas

intralesionalmente se han investigado usando células marcadas y estudiando su

persistencia entre tres y cuatro meses tras la implantación (4, 5). Dichas células

persistieron, si bien en pequeños números. El momento de esta pérdida en el número

de células no pudo ser determinado, y se desconoce cuantas sobrevivieron el

momento de la implantación. Además, otras vías alternativas de administración a la

implantación intralesional han sido sugeridas, dado que la lesión podría realizar un

“efecto llamada” a las CMM.

Nuestra hipótesis es que las CMM se retienen en la lesión tras su implantación

intralesional, y que tras la administración intravenosa sistémica e intravenosa por

perfusión regional las CMM anidan en la lesión.

Material y método

Eficiencia de marcado celular In Vitro: Partes alícuotas con 10 millones de CMM

fueron marcadas con 200MBq de tecnecio-99m pertecnetato sódico (Tc-99m) y 1 vial

de Hexametilpropilenoamina oxima (exametazina, HMPAO)1. Para obtener la

eficiencia óptima de marcado se compararon tiempos de incubación de 10, 20 y 30

minutos y dos diferentes medios de incubación (Dulbeccos Modified Eagles Medium

(DMEMs) y solución salina tamponada de fosfato (PBS)).

Estudio clínico: Se seleccionaron 9 caballos con tendinitis del flexor digital

superficial inducidas por el ejercicio de manera natural (TFDS) y 3 caballos con

dermitis del accesorio del tendón flexor digital profundo (DAFDP). Las lesiones

tenían que ser agudas, con menos de 21 días de duración. Tras su evaluación clínica y

ecográfica se obtuvieron del esternón 2 x 9.5 ml de partes alícuotas de medula ósea,

siguiendo protocolos ya publicados (6). CMM se aislaron y cultivaron por protocolos

estandarizados (3, 6). Tras unas 3 semanas, 3 alícuotas con 10 millones de CMM de

cada paciente cada una se enviaron al Hospital de Referencia La Equina, una cada

semana en 3 semanas consecutivas. Las CMM se marcaron con Tc-99m HMPAO

antes de cada administración. La eficiencia de marcado se midió en cada alícuota.

Las células fueron administradas a cada caballo por las siguientes 3 vías de

administración, al azar y en semanas consecutivas:

1) Implantación por inyección intralesional bajo guía ecográfica (intralesional - IL)

2) Administración intravenosa en la vena digital palmar en la región de la cuartilla mientras un torniquete era mantenido durante 30 minutos en la

zona metacarpiana proximal (perfusión regional - PR)

3) Administración intravenosa sistémica a través de la yugular (Intravenosa - IV)

1 CERETEC® GE Healthcare.

Las CMM marcadas fueron seguidas durante un período de al menos 36 horas a través

de una gammagrafía a los 5 minutos, 1, 3, 6, 12, 24 y 36 horas tras cada tratamiento.

Las imágenes de gammagrafía se obtuvieron de la zona de la lesión, misma zona

contralateral, el pulmón derecho y el tiroides derecho. Además, en cada una de estas

regiones se realizó recuento de destellos a 1 cm de la piel. Estos valores y los valores

obtenidos en las imágenes de gammagrafías definiendo regiones de interés (RDI) se

analizaron estadísticamente.

Resultados:

Eficiencia de marcado celular In Vitro: La máxima eficiencia de marcado celular con

Tc-99m HMPAO fue 55% tras 30 minutos de incubación y el uso de DMEMs como

medio de incubación. La viabilidad celular sobrepasó el 90% tras el marcado.

Estudio Clínico: La eficiencia de marcado varió entre el 2.7% y el 22.5 % con una

media del 9.2%. Las células se retuvieron en la lesión tras la implantación

intralesional (Fig. 1). Cálculos de persistencia celular durante las primeras 24 h

sugieren que aproximadamente un 10% de las células implantadas estaban presentes a

las 24 horas.

La administración intravenosa resultó en una distribución de las células mayormente

en el pulmón, sin trazas detectable en la lesión. Por el contrario, una actividad

significativa se encontró en la lesión en 11/12 caballos tras la perfusión regional. (Fig.

1).

Discusión:

La baja eficiencia de marcado obtenida durante el ensayo clínico se debe

posiblemente al mayor período de tiempo que transcurrió entre la elución del Tc-99m

y el marcado con HMPAO, debido a que la distancia entre la radiofarmacia que surte

al Hospital de Referencia La Equina es mayor que en el caso del Royal Veterinary

College, donde se realizó el estudio In Vitro. Para el marcado celular el tiempo

transcurrido entra la elución y el marcado no debe sobrepasar las 2 horas, ya que el

decaimiento del Tc-99m interfiere con el marcado.

El número de células implantadas necesarias para obtener un efecto clínico no es

conocido. La mayor retención de células tras la administración se produce en el

tratamiento intralesional, indicando que esta es todavía la vía más efectiva para hacer

llegar un mayor número de células a la lesión. Sin embargo, durante las primeras 24 h

se pierden una elevada porción de estas células implantadas.

La perfusión regional parece una vía alternativa que promete aplicación clínica. No

cabe duda que se produce un efecto llamada por parte de la lesión a CMM que se

mantienen regionalmente durante 30 minutos. En aquellas lesiones que no cursan con

una imagen ecográfica con lesión central y definida o en lesiones de naturaleza difusa

como son las lesiones del origen del ligamento suspensor, la perfusión regional es una

vía alternativa viable. Es necesario investigar si en caso aun más agudos que los

estudiados en el presente proyecto y en lesiones crónicas también se ejerce este

“efecto llamada”.

La ausencia de actividad en la lesión tras la administración intravenosa podría estar

relacionada con una ausencia de atracción de la lesión a CMM, aunque la baja

eficiencia de marcado obtenida hace difícil sacar conclusiones.

References

1. Schnabel LV, Lynch ME, van der Meulen MC, Yeager AE, Kornatowski MA,

Nixon AJ. J Orthop Res. 2009 Oct;27(10):1392-8.

2. Nixon AJ, Dahlgren LA, Haupt JL, Yeager AE, Ward DL. Am J Vet Res.

2008 Jul;69(7):928-37.

3. Godwin EE, Young NJ, Dudhia J, Beamish I, Smith RKW. Equine Vet J.

2011:In press.

4. Guest DJ, Smith MR, Allen WR. Equine Vet J. 2008 Mar;40(2):178-81.

5. Guest DJ, Smith MR, Allen WR. Equine Vet J. 2010 Oct;42(7):636-42.

6. Smith RK, Korda M, Blunn GW, Goodship AE. Equine Vet J. 2003

Jan;35(1):99-102.

Figura 1: Gammagrafía de una lesión del tendón flexor digital superficial en su

porción distal, a 22 cm distal hueso accesorio del carpo (imagen ultrasonográfica de la

lesión a la izquierda). Fueron realizadas a las 3 horas, 6 horas y 12 horas tras la

implantación intralesional (fila superior) y la perfusión regional intravenosa en la

vena palmar digital a nivel de la cuartilla (fila inferior). Nótese la actividad presente

en el tendón flexor digital superficial distal (flecha continua). La flecha discontinua

denota actividad persistente en los primeros momentos en los vasos sanguíneos.

Agradecimientos: Este proyecto ha sido parcialmente apoyado por la Consejería de

Innovación, Ciencia y Empresa de la Junta de Andalucía. Agradecemos a IBA

Molecular Spain – Molypharma su apoyo logístico durante el proyecto. Este proyecto

no se podría haber llevado a buen término sin la ayuda de VetCell Bioscience en el

cultivo de las células madre mesenquimales.