3.3 la inmovilizacin celular y enzimtica
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La Utilización Industrial de microorganismos recombinantes
La inmovilización celular y enzimática.
Inmovilización
• Confinamiento físico de una enzima o célula en una determinada región del espacio, de manera que su actividad catalítica se retenga, y pueda ser reutilizada.
• 1971, 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New Hampshire, USA.
Biocatalizadores inmovilizados
• Enzimas, células u organelos celulares que se encuentran en un estado tal que se permite su reutilización.
• las enzimas y las células pueden transformarse en catalizadores heterogéneo.
• El biocatalizador se confina a una región determinada a través de la cual se pasa la solución del sustrato, que sale como un producto, libre de catalizador.
Homogéneo: uso único
Heterogéneo: uso continuo
‰
‰
Operación continua
Reutilización
COMPONTETESDE LOS
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
Enzimas Células vivasCélulas muertas
Durante la inmovilización
debe mantenerse la
estructura evitándose el
impedimento estérico del
sitio activo
Necesidad de mantener su
estructura organizada
Requisitos para poder caracterizar unbiocatalizador inmovilizado
1.- DESCRIPCIÓN GENERAL
1.1.- Esquema de reacción1.2.- Enzima y microorganismo1.3.- Tipo de soporte1.4.- Método empleado para la inmovilización
Requisitos para poder caracterizar unbiocatalizador inmovilizado
2.- PREPARACIÓN DEL CATALIZADOR INMOVILIZADO
2.1.- Método de inmovilización, condiciones de reacción.
2.2.- Rendimiento por peso seco, actividad del sobrenadante.
Requisitos para poder caracterizar unbiocatalizador inmovilizado
3.- CARACTERIZACION FISICO- QUIMICA
3.1.-Forma del biocatalizador3.2.-Diámetro medio de partícula húmeda3.3.-Capacidad de hinchamiento3.4.-Comportamiento en columnas 3.5.-Abrasión en reactores agitados3.6.-Abrasión en reactores de lecho fluidizado.
Requisitos para poder caracterizar unbiocatalizador inmovilizado
4.-CINETICA DEL BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO.
4. 1.-Velocidad de reacción.
4.2.- Efecto del tipo de buffer y pH
4.3.- Estabilidad del biocatalizador en el almacenamiento
MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN:
RETENCIÓN QUÍMICA
• Enlaces covalentes• Adsorción• Reticulado (cross-linking)
RETENCIÓN FÍSICA
• Confinamiento en matrices– En geles o polímeros– Micelas reversas
• Confinamiento en membranas– En fibras huecas– En reactores de membrana
Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España
MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN
Adhesión
AdsorciónUniónCovalente
X
1.- No específica2.- Intercambio iónico3.- Hidrofóbico4.- Pseudoafinidad5.- Afinidad
-+
O
HH
OH OH
OH
CH2OH
OLectina Ab
Ag
Colorante
Geles
Confinamiento
1.- Láminas2.- Fibras cóncavas o huecas3.- Encapsulación
Membranas
http://www.uned.es/fac-quim/quimi_inor1/INMOVILIZACION.htm
Métodos de Inmovilización
Retención física Inmovilización química
Adsorción EntrecruzamientoUnión covalenteAtrapamiento o inclusión
Con formación de enlaces covalentesSin formación de enlaces covalentes
Métodos de Inmovilización
Inmovilización por Adsorción
Interacción física, no específica (puentes de hidrógenointeracciones hidrofóbicas, interacciones iónicas, interacciones de van der Waals) entre la proteína enzimática y el soporte.
Alumina, carbón activo, vidrioResinas cambiadoras
El método más sencillo De aplicación general Coste moderado
Estabilidad limitada, se requiere un control riguroso de las condiciones de trabajo para evitar pérdidas de enzima por desorción.
UnionesReversiblesNo covalentes
Retención física Inmovilización química
Adsorción EntrecruzamientoUnión covalenteAtrapamiento o inclusión
Métodos de Inmovilización
Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa
Métodos de Inmovilización
Formación de un polímero altamente entrecruzadoen presencia de la enzima. Esta queda atrapada enlos poros de la matriz polimérica formada.
Se requiere controlar las condiciones de polimerización para que no se produzcan alteraciones en la molécula enzimática
Se puede perder proteína lentamente
Se pueden obtener membranas con enzimas inmovilizadas De aplicación general
Gel de poliacrilamidaPolímeros conductores
Atrapamiento por microencapsulación
Métodos de Inmovilización
Se atrapa la enzima en microcápsulas (1-100 µm diámetro) dentro de membranas semipermeables de polímeros que permiten la difusión de sustratos y productos pero no de la proteína.
Membrana polimérica obtenidaen un proceso de polimerizaciónen la interfase disolución orgánica-acuosa
Se requieren elevadas concentraciones de proteína en disolución acuosa (10 mg/L)
Retención física Inmovilización química
Adsorción EntrecruzamientoUnión covalenteAtrapamiento o inclusión
Métodos de Inmovilización
Métodos Químicos no polimerizantes- Unión covalente
Métodos de Inmovilización
Formación de enlaces covalentes entre el enzima y el soportepero no entre las moléculas de enzima. El tipo de soporte determina la química de la inmovilización
Asegurar que el centro activo de la enzima no se ve afectado por los reactivosempleados en el proceso de inmovilización.Se puede proteger el centro activo con un análogo del sustrato o un inhibidorcompetitivo durante el proceso de inmovilización.
Soporte Enzima
Grupo funcional Soporte
-CONH2
-COOH
-NH2
-OH
-Si(OH)3
Poliestireno, nylon
Carboxymetilcelulosa
Poliacrilamida
Celulosa, agarosa, sephadex
Vidrio poroso
Activación para obtener grupos funcionales reactivos
Unión a través de las cadenas lateralesde los aminoácidos de la secuencia polipeptidica de la proteína
-NH2 Lisina
-OH-Ph Tirosina
-COOH Aspartato Glutamato
-SH Cisteina
-OH Serina
-Nimidazol Histidina
Métodos de Inmovilización – Unión Covalente
1. Método de la acyl-azida para unión a soporte con grupos ácido
OCH2COOHCH3OH
HClOCH2COOCH3
NH2NH2OCH2CONHNH2
OCH2CONHNH2NaNO2
HClOCH2CON3
OCH2CON3 + NH2-ENZIMA OCH2CONH-ENZIMA
Activación de soporte para obtener un grupo acil-azida
Ataque nucleófilo a la acil-azida para dar lugar a un enlace amida
Son más reactivas las aminas primarias (lisina), aunque tambiénreaccionan residuos de cisteina, serina y tirosina.
Métodos de Inmovilización – Unión Covalente
2. Método de la carbodiimida para unión a soporte con grupos ácido
COOH COOC+ C
N
N
R
R´
NH
NH
R
R
La selectividad de la reacción mejora si se añade un derivado de N-hidroxisuccinimida durante la etapa de activación del soporte.Se forma un ester de N-hidroxisuccinimida que forma selectivamenteenlace amida con residuos de Lisina
Activación del soporte para darun derivado acilisourea por reaccióncon carbodiimida
Reaccionan lisina, tirosina, cisteina, serina y metionina
COOC
NH
NH
R
R
+ NH2-ENZIMA CONH-ENZIMA + C
NHR
O
NHR
+ H
Reacción con la enzima
Métodos de Inmovilización – Unión Covalente
3. Unión a través de enlace azo
R NH2
NaNO2
HClR N2 Cl
R N2 Cl HO Enzima R N N
HO
Enzima
+
Activación del soporte para obtener una sal de diazonio
Unión a la enzima a través de un residuo de tirosina
Inmovilización covalente selectiva a través de residuos de tirosina Evita entrecruzamiento enzima-enzima
Retención física Inmovilización química
Adsorción EntrecruzamientoUnión covalenteAtrapamiento o inclusión
Métodos de Inmovilización
Entrecruzamiento
N2N2
Métodos de Inmovilización
ICH2 CHN
O
CH2ICHN
O
(CH2)6
S OC
O(CH2)2 N
O
O
SO C (CH2)2
O
N
O
O
Formación de enlaces covalentes intermoleculares (entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte
Cantidades altas de proteína inmovilizada resistentes a condiciones extremas de pH y temperatura
Las redes de moléculas entrecruzadas que se forman dificultan el acceso del sustrato al centro activo Pérdidas de actividad tras la inmovilización altas
Reactivos bifuncionales más utilizados
Diazobenzidina Hexametileno-bis(iodoacetamida)
Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato
(CH2)3
CHO
CHO
Glutaraldehido
Ejemplo- Entrecruzamiento con glutaraldehido
Métodos de Inmovilización- Entrecruzamiento
Método simple y sencillo Se verifica en condiciones de pH neutro
(CH2)3
CHO
CHONH2-ENZIMA
NH2-ENZIMA+ (CH2)3
CH
CHN- Enzima
N-Enzima
Para minimizar las pérdidas de actividad enzimática se puede optar por un método de co-reticulado: entrecruzamiento de la enzima con una proteína sin actividad enzimática y rica en lisina, ej. albúmina bovina.
Propiedades de las Enzimas InmovilizadasLas propiedades de las enzimas inmovilizadas difierende las de las enzimas en disolución debido a efectos delmaterial soporte y a cambios conformacionales de la enzima
Inmovilización Efectos sobre la estabilidadEfectos en las propiedades cinéticas
1. Efectos en la Estabilidad
Estabilización conformacional de la enzima por uniones multipuntuales enzima-soporte
Mayor resistencia a desactivación térmica o química
Alteración del microentorno de la enzima
Por ejemplo mayor estabilidad en medios orgánicos sobre soportes hidrofílicos
[S1]
[S2]
0 Distancia a la Superficie del soporte
1
[S]
[S]dis.
Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas2. Efectos de la inmovilización sobre las propiedades cinéticas
Capa de difusiónDisolución
SK
Svv
M
max
Los valores de KM y vmax para las enzimas inmovilizadas son aparentes (K’M y v’max)
[S]superficie < [S]disolución
K´M suele ser mayor que KM
4 6 8 10
100
pH
%Actividadrelativa
Propiedades de las Enzimas InmovilizadasEfectos de microentorno Cambio del pH óptimo de la enzima
Quimotripsina en disoluciónQuimotripsina/portador catiónico
Quimotripsina/portador aniónico
Sobre soportes catiónicos:[OH-]superficie>[OH-]disolución
pHsuperficie> pHdisolución
Sobre soportes aniónicos:[H+]superficie>[H+]disolución
pHsuperficie< pHdisolución
Enzimas inmovilizadas
ACOPLAMIENTOACTIVACIÓN
Estrategias para la unión covalente de un enzima a un soporte
Enzima
xxx
Soporte Lavado
x
x
Enzima
Lavado
Soporte
Lavado
x
x
ConjugadoInmovilizado
Ejemplos de enzimas inmovilizadas
Principales características de los métodos de inmovilización:
Características Adsorción Enlacecovalente
Inclusión en matrices
Retención porMembranas
Preparación Simples dificil dificil Simples
Costo bajo elevado moderado elevado
Fuerza de ligación
variable fuerte flaca fuerte
Liberación de enzima
si no si no
Aplicabilidad amplia selectiva amplia Muy amplia
Problemas en la utilización
elevados bajos elevados elevados
Efectos de la matriz
si si si no
Restricciones difucionales
no no si si
Protección microbiana
no no si si
REACTORES
Tanque en agitación
REACTORES
Tanque de alimentación y agitación continua (CSTR)
REACTORES
REACTORES
Lecho compacto
REACTORES
REACTORES
Láminas
REACTORES
REACTORES
Lecho Fluido
REACTORES
Tanque en agitación Tanque de alimentación y agitación continua (CSTR)
Lecho Fluido
Lecho compacto
Láminas
REACTORES