ANÁLISIS DE FACTORES EPIGENÉTICOS EN CÉLULAS PRECURSORAS NEURALESEMBRIONARIAS DE RATÓN EXPUESTAS A HIPERGLICEMIA

Antecedentes: la diabetes altera la expresión génica materna y conduce a defectos del tubo neural (DTN) en elcerebro en desarrollo. Las rutas mecánicas que desregulan la expresión de genes siguen siendo desconocidos. Seplanteó la hipótesis de que la exposición de células madres neurales (NSC) a altos niveles de glucosa /hiperglicemia resultan en la activación de los mecanismos epigenéticos que alteran la expresión génica y eldiferenciación de las células durante el desarrollo cerebral.

Métodos y resultados: NSCs fueron aisladas de embarazo normal y el embarazo - inducida por la diabetes porestreptozotocina y cultivaron en glucosa fisiológica. Con el fin de examinar los cambios epigenéticos inducidospor la hiperglicemia en células madre neurales, la reorganización de cromatina, el estado global de la histona enel residuo de lisina 9 de la histona H3 (acetilación y trimetilación) y metilación del DNA a nivel global fueronexaminados y se encontró que son alterados por la hiperglicemia. En NSC, hiperglicemia aumentó la expresiónde Proteínas Dcx (Doublecortin) y PAFAH1B1 (acetil hidrolasa del factor activador de plaquetas, isoforma 1b ,subunidad 1) concomitantes con disminución de la expresión de cuatro microRNAs (MMU- miR - 200a ,MMU-mir - 200b , MMU- miR - 466a - 3p y MMU-mir -466 d- 3p) predicho para apuntar a estos genes .Lacaída de microRNAs específicos de células madre neurales se tradujo en una mayor expresión de proteínasDCX y PAFAH1B1 que confirma la predicción y alteró la diferenciación NSC mediante el aumento de laexpresión de marcadores de linaje neuronal y glial.

Conclusión / INTERPRETACIÓN: Este estudio reveló que la hiperglicemia altera los mecanismos epigenéticosen células madre neurales , lo que resulta en la expresión alterada de algunos genes de control del desarrollo quepueden servir de base para los defectos del tubo neural . Dado que los cambios epigenéticos son reversibles,pueden ser dianas terapéuticas valiosas para mejorar los resultados fetales en el embarazo diabético.

INTRODUCCIÓN

La diabetes gestacional es un factor de riesgo bien conocido para las anomalías congénitas en diversos sistemasde órganos, incluyendo el sistema nervioso [ 1 ] - [ 3 ] .El control de pre-conceptual de la diabetes hademostrado reducir la incidencia de anomalías congénitas en madres diabéticas [ 4 ] .Por otro lado un controlestricto de la glicemia después de la organogénesis y embriogénesis comienzan a ser insuficientes para preveniro revertir los defectos congénitos que ya han ocurrido [ 5 ] , [ 6 ] .

Los perfiles de expresión génica global de desarrollo del cerebro en embriones de ratones diabéticos hademostrado la expresión diferencial de varios genes que controlan diversas funciones tales como elmetabolismo, el proceso fisiológico celular, la progresión del ciclo celular y la migración celular durante eldesarrollo del cerebro [7]. Las células madre neurales (NSC) son células pluripotentes de auto-renovación deque dan lugar a las células neuronales y gliales (astrocitos y oligodendrocitos) en el sistema nervioso central [8].Se ha demostrado que la diabetes materna altera la expresión de varios genes implicados en la neurulación [9] ,[10] , la proliferación y la especificación de la diferenciación celular [ 11 ] de células madre neurales quepueden ser la base para defectos del tubo neural. En el cerebro en desarrollo, NSC se diferencian en los tipos decélulas neuronales y gliales en una manera secuencial. La especificación de la diferenciación de NSC estádeterminada por señales extracelulares, factores de transcripción y programas intracelulares tales como laregulación epigenética de la expresión génica [12] - [14] . Recientemente, los microRNA ( miRNA) handemostrado ser esenciales en el control post-transcripcional de la diferenciación de NSC y la regulación de laexpresión génica [13] , [15] .

Cambios en la dieta en donantes de metilo han mostrado alterar la metilación del DNA y las histonas [16]. Losestudios en animales han puesto de manifiesto que una dieta deficiente en colina gestacional resulta en ladisminución de la metilación en los genes que controlan el desarrollo cerebral [17]. Por lo tanto, es evidente quelos mecanismos epigenéticos fetales pueden ser influenciados por la nutrición materna o trastornos metabólicos.Estos cambios epigenéticos que se adquieren durante la embriogénesis, incluso puede tener efectos a largo plazosobre la progenie después del nacimiento [18] , [19] . Se ha demostrado que el alto nivel de glucosa provocaalteraciones persistentes en la expresión génica en células endoteliales aórticas humanas [20] y la línea celularmonocítica humana [21] a través de modificaciones de las histonas. Además, el exceso de glucosa puedeaumentar la acetilación de histonas mediante el aumento de acetil CoA en el núcleo [22], lo que sugiere unarelación entre la hiperglicemia materna y el epigenoma fetal.

Por lo tanto, la hipótesis de que la exposición de células madre neurales a la hiperglicemia resulta en laactivación de los mecanismos epigenéticos (modificación de la cromatina, metilación del DNA y los genesmediada por miRNA) que alteran la expresión de los genes durante el desarrollo del cerebro. Para hacer frente aesto, hemos utilizado células madre neurales aisladas del cerebro anterior de embriones no malformados deembarazo con diabetes inducida por estreptozotocina y se cultivaron en medio que contiene los glucosa aconcentración fisiológica (PG, 5 mmol/l) para examinar la reprogramación epigenética in utero causada por lahiperglicemia materna. En primer lugar, se analizó el estado de metilación de histonas y el DNA de célulasmadre neurales para determinar los cambios inducidos por la hiperglicemia en ellos. Con el fin de examinar elefecto de la diabetes materna en la regulación epigenética de genes implicados en el NSC especificación deldiferenciación se seleccionaron dos genes, doblecortina (DCX), y la acetil hidrolasa del factor activador deplaquetas, isoforma 1b , subunidad 1 (PAFAH1B1), que están implicados en la neurogénesis y la migraciónneuronal. Estos genes fueron seleccionados ya que se encontraron sus niveles de expresión alterada en eldesarrollo del cerebro de embriones malformados de embarazo con diabetes (en nuestro análisis de microarraysde cDNA anterior) [7]. Se identificaron cuatro miRNAs que se prevé que actúan sobre Dcx y PAFAH1B1 y sedeterminó si Dcx y PAFAH1B1 fueron objeto de estos miRNAs mediante la alteración de los niveles demiRNA específicos en células madre neurales. Por último, se analizó el papel de cada miRNA en ladiferenciación de NSC después de la inactivación de miRNAs específicos en células madre neurales. Sedemuestra por primera vez que la hiperglicemia altera los mecanismos epigenéticos en NSCs que puedenformar la base de los defectos del tubo neural se observan en el embarazo diabético.

MATERIALES Y MÉTODOS

Declaración de Ética

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la UniversidadNacional de Singapur (IACUC) (número de autorización 122\09) y todos los procedimientos fueron deconformidad con sus directrices.

Animales y cultivo de NSCs

La diabetes fue inducida en hembras de ratones albinos suizos sanos 6-8 semanas de edad (Centro de recursosanimales, CARE, NUS) por una sola inyección intraperitoneal de estreptozotocina (STZ, 75 mg/kg de pesocorporal, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) recién preparada buffer citrato 0,01 M de pH 4,5. Unasemana más tarde, la glicemia de los ratones se probó utilizando un medidor de glucosa en la sangre(laboratorios Abbott, Illinois, EE.UU.) y ratones con niveles de glucosa no-en ayunas > 200 mg/dl fueron

Comentario [lm1]: Sustancia quedestruye las células beta del páncreas ycausa diabetes inducida.

confirmados como diabéticos y seleccionados para el apareamiento. El apareamiento temporizado se llevó acabo mediante la colocación de 3-4 ratones hembra diabéticos de edad determinada emparejados con ratonessanos de sexo masculino, en jaulas durante la noche. El día en que se ve el tapón de copulación se cuenta comodía embrionario 0.5 (E 0.5). Sólo los embriones de los ratones embarazadas con glucosa no-en ayunas > 300 mg/ dl se utilizaron como grupo experimental. Las ratas preñadas emparejados por edad de control fueronadquiridas de CARE, NUS. En E13.5, los embriones fueron sacados por cesárea en ratones diabéticos y decontrol que fueron anestesiados con pentobarbital (150 mg / kg de peso corporal). Todos los procedimientos queutilizan animales de laboratorio fueron de acuerdo con las directrices de la IACUC, Universidad Nacional deSingapur.

Exposición in vitro de células madre neurales a glucosa alta

30-50 neuroesferas derivadas de embriones de embarazo de control E13.5 cultivadas en medio PG setransfirieron a placas de 6 pocillos que contienen 2 ml de medio con alta concentración de glucosa (HG, 40mM/l de D-glucosa) y se cultivaron durante 48 h.

Diferenciación de neuroesferas

5-10 neuroesferas derivadas de embriones E13.5 de control o de diabetes gestacional se sembraron por pocillode una placa de 24 pocillos que contienen cubreobjetos recubiertos con poli-ornitina. Cada pocillo contenía 500µl de medio con la concentración PG y 2% de FBS (y sin EGF) con el fin de inducir la diferenciación. Lascélulas madre neurales se dejó diferenciar por 3 días o 6 días in vitro después de que los porcentajes de GFAP,Map2 o NG2 células positivas se estimaron mediante inmunotinción.

Inmunotinción

Para la inmunotinción, las neuroesferas o células diferenciadas se fijaron con paraformaldehído glacial al 4%(PFA) durante 30 min y las células fijadas se permeabilizaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS)que contenía 0,1 % de Triton X-100 (PBS - Tx) durante 20 min. Posteriormente, las células se bloquearon con 5% de suero normal de cabra durante 30 min antes de la incubación con los diferentes anticuerpos primarios. Losanticuerpos primarios utilizados fueron anticuerpo de conejo anti-GFAP (1:500, Chemicon, Temecula, CA,EE.UU.), anticuerpo de conejo anti-Map2 (1:500 , Chemicon), anticuerpo de conejo anti-Ng2 (1:200 Chemicon)o anticuerpo de ratón anti-nestina (1:500, Millipore, EE.UU.) durante la noche a 4° C. El día siguiente, lascélulas se incubaron con anticuerpo de cabra conjugado con Cy3 anti-IgG secundario de conejo (1:100 ,Chemicon ) o anticuerpo de conejo anti-IgG secundario de ratón (1:100 Chemicon) durante 1 h a temperaturaambiente . Por último, el núcleo se contratiñó con DAPI y los cubreobjetos se montaron en portaobjetos devidrio con medio de montaje fluorescente (DAKO , EE.UU.) . Las imágenes fueron capturadas con OlympusFV1000 microscopio confocal . Para estimar el porcentaje de Map2 o GFAP o NG2 células positivas , imágenesconfocales de al menos cinco campos aleatorios fueron capturados para cada muestra . El número de célulaspositivas (Map2 o GFAP o Ng2) se contó en cada campo y los datos se representan como porcentaje de célulaspositivas ( Map2 o GFAP o Ng2 ) en relación con el número total de células en ese campo.

Microscopía Electrónica

NSC de varios grupos se recogieron por centrifugación (800 rpm / 5 min / 4 º C) y se lavaron dos veces conPBS, después de lo cual las células se fijaron (2% de PFA, 3% de glutaraldehído en PBS) durante 1 h atemperatura ambiente. Las células fijadas se recogieron por centrifugación, se lavaron tres veces con PBS y seincubaron en solución de PBS durante la noche a 4 ° C. Las células fueron entonces puesto fijo en OsO4 al 1%,pH 7,4 durante 2 h a temperatura ambiente después de lo cual se lavaron con tampón de fosfato 0,1 M (pH

7,4). Las células se deshidrataron luego a través de una serie ascendente de etanol a temperatura ambiente y seinfiltraron con 100% de acetona: resina (1 6) durante la noche a temperatura ambiente. Después de trescambios en la resina, las células fueron embebidas en resina fresca y polimerizaron a 55 ° C durante 1h. Secciones corte se apoya en las redes (150 nm) y los portaobjetos se tiñeron con acetato de uranilo (10 min) ycitrato de plomo (8 min) a temperatura ambiente. Las imágenes fueron capturadas utilizando Bio CM Doble 120(Philips) microscopio electrónico.

Extracción de proteínas histona y Ensayos

Total de las proteínas histonas se aislaron células madre neurales de diferentes grupos utilizando EpiQuik kit deextracción total de las histonas (Epigentek, Farmingdale, NY) siguiendo las instrucciones de losfabricantes. Extractos de las histonas (2 g) de cada muestra se utilizó para cuantificar la histona H3K9trimetilacion o acetilación utilizando EpiQuik kit Global trimetil histonas H3K9 cuantificación (Epigentek,Farmingdale, NY) o EpiQuik kit Global histona acetil H3K9 cuantificación (Epigentek) siguiendo el protocolodel fabricante.

Aislamiento de ADN

ADN genómico fue extraído de células madre neurales de diversos grupos utilizando la sangre y el kit de tejidoDNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN extraído se cuantificó usando espectrofotómetro Nanodrop.

Global metilación Cuantificación de ADN

El ADN genómico (200 ng) de cada grupo NSC se utilizó para cuantificar los niveles globales de metilación delADN usando el kit Methylamp global de la metilación del ADN cuantificación (Epigentek, Farmingdale, NY) yse siguieron las instrucciones del fabricante. Todas las muestras se analizaron por duplicado. Una curvaestándar se representó gráficamente utilizando el control de ADN metilado suministra en el kit y la metilacióndel ADN% se calculó sobre la base de la curva estándar.

Aislamiento de ARN

El ARN total se extrajo a partir de los grupos experimentales y de control usando el kit de mirVana ™(Ambion, Carlsbard, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN aislado se utilizó para elanálisis de los genes miARN o ARNm QRT-PCR.

Síntesis de ADNc y Análisis de ARNm

La transcripción inversa se realizó usando 2 ARN mu g y 2 l oligodT, 200 U de virus de la leucemia murinaMolony (M-MLV) la transcriptasa inversa, 5 U de RNasin (Promega, Madison, WI, EE.UU.), 2 mmol / L decada dNTP, en un volumen de reacción de 25 l. La expresión de mRNA se cuantificó por análisis de tiempo realRT-PCR llevada a cabo en Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) 7,900instrumento HT usando mezcla maestra de 10 l que contiene 5 l de SYBR verde (Qiagen, Hilden, Alemania), 1mM / l de cada cebador ( Tabla 1 ), 1 l de cDNA y agua libre de nucleasa en placas de 96 ópticas bien rápido. Elpliegue del cambio de la expresión de ARNm se calculó por 2 -ΔΔCt método [26] .

Aislamiento de proteínas y Western Blot

Las proteínas fueron extraídas de células madres neurales de mamífero usando proteínas de mamíferos paraextracción (M-PER, thermo scientific, Rockford, IL EEUU) , siguiendo las instrucciones indicadas por elfabricante. La proteína extraída se cuantifico usando el método de Bradford (Bio -Rad , Hercules , CA ,EE.UU), 20 µg de cada muestra de proteína se desnaturalizo a 95°C durante 5 min y se separó en un 10 % deSDS –PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas PVDF y se bloquearon con 5 % de leche sin grasadurante 1 h en una sala temperada.

Los blots fueron incubados con un AC primario: Un anticuerpo de conejo anti- DCX (1:1000 , Abcam ,Cambridge , MA) , anticuerpo de conejo anti- PAFAH1B1 (1:1000 , Abcam , Cambridge, MA) o un anticuerposde ratón anti- beta actina ( 1:5000 , Sigma , St.Loius , MO , EE.UU. ) durante la noche a 4°C .

Los blots con un anticuerpo secundario conjugado anti-raton o anti-conejo HRP (Pierce , Rockford, IL , EE.UU.) fueron incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. Los blots fueron desarrollados con un reactivo dequimioluminiscencia (Pierce , Rockford, IL , EE.UU. ) y cuantificados con un densitómetro (Bio -Rad ,Hercules , CA , EE.UU. ) utilizando una cantidad de software (Bio -Rad, Hercules, CA, EE.UU. ) . la carga deproteínas fue confirmada por una cinta fluorescente (reflectante) y reconfirmada por un por un marcaje conanticuerpos beta actina.

Bisulfito de Clonación y secuenciación

DNA (1µg) de cada grupo de células madre neurales fue tratada con bisulfito y purificada utilizando el kit debisulfito de Epitect (Qiagen, Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo del fabricante. Cebadores específicos debisulfito fueron diseñados utilizando Methylprimer expreso softwareV1.0 (Applied Biosystems, Foster City,CA, EE.UU.), los cuales abarcan desde 350 hasta 400 pb de islas CpG en el promotor del gen. El DNA tratadocon bisulfito fue amplificado por PCR y las amplificaciones fueron purificadas, se subclonaron en el kit declonación TOPO TIE (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) el plasmido de DNA fue aisladode 6 colonias positivas y secuenciado. Los electroferogramas fueron analizados usando el software analizadorBiQ (Max-Planck Institut für Informatik, Alemania) y el patrón de metilación se representa como BJHGG.Círculos abiertos representan sitios CPg desmetilados y los círculos cerrados representan sitios metilados CpG.La seuencias de primer usados para la PCR y secuenciación se enumeran en la tabla s1

Predicción del miRnA target

Se utilizó la base de datos miRWalk (http://www.ma.uniheidelberg.de / APPA / ZMF / mirwalk /) para predecirla interacción miARN-mRNA en el 3´UTR de los genes en estudio. Los resultados de la investigación seresumen en la tabla 2

Hibridación in situ

NSCs del embarazo normal fueron transferidas a 24 placas con polilisina cubiertas con cubreobjetos y fuerondejadas adheridas por 48horas. La sonda de fluoresceína miRCURY fueron adquiridas del raton U6 MMU-mir-200b y MMU-mir-466d-3p de Exiqon (Vedbaek, Dinamarca) (Tabla S2 en Tablas S1) Seguimos unprotocolo de publicación de hibridación in situ Brevemente, las células fueronfijadas con PFA al 4%, sepermeabilizaron con 0.1% de PBS-Tx, y acetilado con una solución de acetilación que contiene anhídridoacéticoy trietanolamina. Las sondas se desnaturalizaron y luego se hibridaron toda la noche a temperaturas ene l rangode 55 °C a 60°C (que fue 22°C menor que la temperatura de melting de la sonda. Luego de la hibridación, se

Comentario [J2]: Las células madre soncélulas con capacidad de renovarsecontinuamente por mitosis y con lapropiedad de diferenciarse en muchostipos de células del organismo

Comentario [J3]: Se trata de la unióndel colorante AZUL DE COMASSIE a lasproteínas, generando un intenso color azuly un absorbiendo a longitudes de onda masgrandes que el colorante libre. Interfierensoluciones básicas y detergentes

Comentario [J4]: Es la emisión deradiación electromagnética, UV o visibleque se observa cuando una especieelectrónicamente excitada, producida poruna reacción química a T°A regresa a suestado fundamental

Comentario [J5]: Regiones del dnalibres de metilación, generalmente en lospromotores de los genes

Comentario [J6]: Graficos realizadoscon los resultados de una electroforesis

Comentario [J7]: Técnica basada en lapropiedad de los acidos nucleicos dehibridarse entre si. Se utilizan fragmentosmarcados de DNA con una secuencia deRNA o con una sonda

hicieron lavados de 75 a 80°C , (que fueron 20°C mayor que la temperatura de hibridación). Las NSCs, fueroncontrateñidas con DAPI (1 µg/ml ,sonda molecular) y fueron montados cubreobjetos sobre el cristal con unmedio de montaje fluorescente (DAKO), las imágenes fueron obtenidas con microscopio confocal olimpusFV1000

Análisis de miRNA

Los primers miRNA de ratón mmu-miR-200a , mmu-miR-200b,mmu-miR-466a -3p, mmu-miR- 466d -3Pfueron obtenidos de ( applied Byosistems Foster city,CA,USA) y el conjunto de cebadores de controlsnoRNA234 se utilizó para normalizar las muestras. El ARN total fue transcrito de manera inversa usandocebadores específicos de los genes miARN RT stem-loop (tallo-bucle) y, posteriormente, fue detectada laexpresion de los genes miARN utilizando cebadores específicos de genes miARN. El primer MMU-124 deraton y el control de primers U6 se obtuvieron de Exiqon .El ARN total fue convertido a Cdna utilizando unkit de sintesis universal ( Exiqon.Vedback,Denmark) y el cDNA se utilizó para cuantificacion de mi-ARN 126.La expresión de mi-RNA se cuantificó por tiempo real RT-análisis de PCR utilizando 96 placas ópticas . Eldoble cambio en la expresión de los genes miARN se calculó por la fórmula 2^ AACT

miRNA Knock Down

Las celulas NSCs que estan presentes en un embarazo normal fueron cultivadas en una concentración de PGque contiene el medio, las que fueron utilizadas para miRNA knockdown. Antes de la transfección, los NSCsse tripsinizaron suavemente para dar células individuales y 2x10^5 celulas se sembraron en placas de 24pocillos La transfection también se realizó utilizando X-tremeGENE reactivo de transfección de siARN(RocheApplied Sciences,Mannheim, Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante.El extremo 5 fue marcadocon fluorescencia mediante miRCURY LNA e inhibidores LNA mMU-miRNA-200b, mMU-mir-466d-3p, ymiRCURY LNAMMU-miR-200a, MMU-miR-466a-3p los que se obtuvieron de Exiqon (Vedback, Denmark) (S3 tabla en tablasS1). Los complejos de transfección se prepararon en Opti-MEM (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad,EE.UU.) además se añadió a las células en concentración final de 20Nm/L .El extremo 5 marcado confluorescencia se utilizó como control negativo. Luego de 48 horas después de la transfección, la expresión de laproteina se observo en los mRNA Blanco y fue analizada mediante western blot..

miRNA Knockdown y Especificación de linaje de NSCs

Para la especificación de linaje, las células madres neurales fueron cosechadas por centrifugación 48 h despuésde la caída con inhibidores de miARN y tripsinizaron para producir células individuales .Cerca de 10.000células de scrambled o miRNA knockdown se sembraron por triplicado (una para GFAP, Map2 y Ng2) enplacas de 24 pocillos que contienen cubreobjetos recubiertos con poli - ornitina (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO,EE.UU.). Con el fin de inducir la diferenciación, el EGF fue retirado del medio de cultivo y 2 % de FBS seañadió al medio y las células se cultivaron durante 24 h antes de proceder con la inmunotinción utilizandomarcadores de linaje de células gliales y neuronales. Para estimar el porcentaje de células, confocal de imágenesde al menos cinco campos aleatorios fueron capturados para cada diapositiva. El porcentaje de GFAP, Ng2 yMap2 células positivas se calculó en células miRNA knockdown y normalizado a células scrambledtransfectadas.

Análisis estadístico

Comentario [J8]: Es un colorantenuclear fosforescente, se excita con luz UVpara producir una fuerte fluorescenciacuando está unido al DNA

Comentario [j9]: Es una tienda onlinedonde se puede comprar oligos,genes,material para realizar PCR,etc

Comentario [j10]: Es una tienda onlinedonde se compran miRNA para realizardistintas tecnicas moleculares comomicroarrays,qPCR,etc

Comentario [j11]: Esta ES LAformulaque se utiliza para calcular la cantidad dehebras o DNA que se ha formado,la vimosen clases es exponencial

Comentario [j12]: Trabajan conanalisis celular,genes knockdown,expresión genica.

Comentario [j13]: ™ InhibidormicroRNA Target LNA.

Comentario [afhc14]: Tripsinización:Procedimiento mediante el cual, se aplicauna solución de tripsina a células adheridaspara que estas se suelten

Comentario [afhc15]: Proteína glialfibrilar ácida,

Los datos se representan como media 6 del SD de al menos tres experimentos independientes. Prueba de la t deStudent se hace mediante el uso de hoja de cálculo Microsoft Excel y los datos se consideran significativoscuando p es 0.05.

RESULTADOS

Reorganización de la cromatina en NSCs expuestos a hiperglucemia

En este estudio, se aislaron células madres neurales a partir de embriones de embarazo normal y de embarazodiabético y se cultivaron en medio con PG. Además, células madres neurales derivadas de embriones deembarazo normal se cultivaron en medio con glucosa elevada (HG) durante 48 h con el fin de servir comomodelo in vitro de embarazo diabético. El efecto de la hiperglucemia en la organización de la cromatina en losnúcleos de células madres neurales se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión como se planteóla hipótesis de que la hiperglucemia podría provocar modificaciones de la cromatina en células madres neurales.No se encontraron grupos incrementados de heterocromatina (indicado como oscuros, regiones densas) en laperiferia nuclear de células madres neurales de embarazo diabético (Fig. 1C) y que expuestos a HG in vitro(Fig. 1B), en comparación con el control (Fig. 1A) lo que sugiere es que la hiperglucemia provoca lareorganización de la cromatina en células madres neurales embrionarias. Esto también proporciona evidencia deque la reorganización de la cromatina observada en células madres neurales a partir de embriones de embarazodiabético era de hecho el efecto de la hiperglucemia como se obtuvieron resultados similares cuando NSC(derivada de embarazo normal) se cultivaron en HG in vitro.

Incremento Global de la trimetilación de Histona H3K9 y Metilación del DNA y Disminución de Acetilación dehistona H3K9 en NCSs Expuestas a Hiperglicemia.

La cromatina consiste en DNA que puede ser metilado y proteínas histonas que se someten a modificacionesque controlan el empaquetamiento y la organización de la cromatina. Por lo tanto, nosotros postulamos que lareorganización de la cromatina observada en las células troncales (madre) neurales expuestas a hiperglicemia seasocia con modificaciones de histonas o modificaciones al DNA. Por tanto, se analizó el estado de la histonaH3 lisina 9 (trimetilación y acetilación) y niveles de metilación del DNA en las Células troncales neurales. Elestado de modificaciones de las histonas se examinó por un enfoque basado en ELISA utilizando dosanticuerpos de histonas: anti- trimetil histona H3 lisina 9 (H3K9me3) y anti – acetil histona H3 lisina 9(H3K9ac). La razón para la selección de estos dos anticuerpos fue porque H3K9me3 se asocia generalmentecon silenciamiento transcripcional, mientras que H3K9ac se asocia con activación transcripcional.Curiosamente, NSCs de la diabetes gestacional (130.42 ± 20.41 % , p<0.05 ) y las que se han expuesto a HG invitro ( 125.48 ± 7.98 % , p <0,05 ) mostraron un aumento significativo en silenciamiento transcripcional,cuando se compara con el control (90.60 ± 5.01 %) (Fig. 1D). Adicionalmente, las NSCs de la diabetesgestacional ( 72.63 ± 3.79 % , p,<0.05 ) y las expuestas a HG in vitro ( 78.34 ± 4.05 % , p< 0,05 ) mostraronuna disminución significativa en activación de la transcripción en comparación con el control ( 90.13 ± 7.31 % )( Fig. 1E ) . Además, se analizó el efecto de la hiperglucemia en la metilación del ADN global utilizando unenfoque basado en ELISA. Se encontró que el porcentaje de metilación del ADN en NSCs de la diabetesgestacional (0.45 ± 0.02 %, p< 0.05) y las expuestas a HG in vitro (0.49 ± 0.04 %, p<0,05) se incrementósignificativamente aumentado en comparación con el control (0.36 ± 0.06 %) (Fig. 1F).

Comentario [afhc16]: Laheterocromatina son regiones de lacromatina más compactas, condensadas,empaquetadas. no se puede replicar enesta conformación.

Comentario [C17]: NSCs = Neural StemCells. Células troncales neurales

Comentario [C18]: NSCs = Neural StemCells

Comentario [C19]: Hiperglicemia

Regulación Epigenética De Genes Implicados en la Neurogénesis, Migración Neuronal En NSCs Expuestas aHiperglicemia

Hemos demostrado anteriormente que la diabetes maternal perturba la neurogénesis y la migración neuronal enel desarrollo tubo neural resultando en NTDs . Para examinar si la expresión alterada del gen se debía a cambiosen mecanismos epigenéticos, seleccionamos dos genes a saber, DCX y PAFAH1B1 que están involucrados enneurogénesis y migración neuronal. La expresión del mRNA y proteína de DCX y PAFAH1B1 en célulasmadre neurales del control y de la diabetes gestacional fueron analizados por QRT -PCR (Fig. 2A) y Westernblot (Figs. 2B, C). La expresión del mRNA de DCX (4.79 ± 1.99 vs 1.00 ± 0.13 vs - pliegues, p<0.05) yPAFAH1B1 (2.55 ± 0.93 vs 1.04 ± 0.33 -pliegues, p < 0.05) aumentaron significativamente en NSCs de ladiabetes gestacional en comparación con el control (Fig. 2A). Adicionalmente, las cantidades de proteína deDCX (2.86 ± 1.93 vs 1.00 ± 0.60- pliegues, p<0.05) y PAFAH1B1 (3.05 ± 0.88 vs 1.00 ± 0.51-pliegues,p<0.05) aumentaron significativamente en células madre neurales de la diabetes gestacional en comparacióncon el control (Fig. 2C). Además, la expresión del ARNm de DCX (1.73 ± 0.35 1.08 ± 0.47-pliegues, p< 0.05) yPAFAH1B1 (1.36 ± 0.16 vs 1.00 ± 0.06-pliegues, p<0.05) se incrementó significativamente en células madreneurales expuestos a HG in vitro en comparación con las del control (Fig. 2D). Con el fin de identificar si loscambios en la expresión del ARNm en células madre neurales expuestas hiperglicemia (in vivo e in vitro) sedebían a los cambios en la metilación de CpG, se realizó una conversión bisulfito seguido por la clonación ysecuenciación de ADN aislado. No hubo cambios en la metilación de CpG para el promotor del genPAFAH1B1 en células madre neurales de la diabetes gestacional o las que se expusieron a HG in vitro encomparación con el control (Fig. S2). Islas CpG se encontraron ausentes en el promotor del gen DCX.Posteriormente, los porcentajes de células neuronales y gliales fueron calculados desde el incremento de laexpresión de DCX y PAFAH1B1 por la hiperglicemia. Las neuroesferas de control y de la diabetes gestacionalfueron dejadas para su diferenciación en un medio con PG y 2 % de FBS (sin EGF) durante 3 días o 6 días invitro y los poblaciones neuronales y gliales se identificaron mediante inmunotinción con Map2 (proteínaasociada a microtúbulos 2) o GFAP (proteína glial fibrilar ácida) o Ng2 (neurona- glial antígeno 2) o Nestin(Fig. 2E - L y . Fig. S3 A- H) y cuantificadas. Los porcentajes de las células neuronales y gliales positivas seestimaron después de 3 y 6 días de diferenciación con el fin de comprobar si la diferenciación prolongadaalteraría la proporción neurogénesis: gliogenesis. Todas las células diferenciadas de las NSCs del control y dela diabestes gestacional mostraron inmunorreactividad al Nestin (fig. 2 K, L , y . Fig. S3 G, H). El porcentajede células positivas a la Map2 aumentó significativamente a los 3 días (37.55 ± 4.64 vs 28.41 ± 5.30 vs %,p<0.05) y 6 días (43.63 ± 4.57 vs 30.17 ± 5.71 % , p<0.05) post diferenciación . Sin embargo, los porcentajes decélulas positivas a GFAP a los 3 días ( 44.19 ± 10.97 vs 77.04 ± 4.53 % , p<0.05 ) y 6 días ( 45.4764.72 vs75.5263.10 % , p, 0.05 ) y las células positivas a los 3 días ( 5.05 ± 1.00 vs 8.8 ± 61.08% , p<0.05 ) y 6 días (4.14 ± 0.73 vs 9.43 ± 0.96 % , p<0.05 ) se redujeron significativamente en las células diferenciadas a partir decélulas madre neurales de la diabetes gestacional en comparación con el control lo que significa que lahiperglucemia aumenta la neurogénesis y disminuye la gliogénesis (Fig. 2M ) .

La hiperglicemia altera la expresión de miRNAs en las células madres neuronales.

Los miRNAs destinados al target 3’ UTR de los genes seleccionados (DCX y PAFAH1B1) fueron identificadosa partir de la base de datos miRWalk. Entre varios miRNAs destinados para el target de los genes propuestos, seanalizaron cuatro miRNAs de dos familias (Tabla 2) que eran objetivos comunes a los genes seleccionados. Serealizó la hibridación in situ de dos miRNAs representativos (MMU-mir-200b y MMU-mir-466d-3p)seleccionados de cada familia de genes miARN que se investigó en este estudio (familia MMU-mir-200 yMMU-mir-466) en forma imparcial para detectar si estos miRNAs se expresan en células madre neurales (Figs.

Comentario [C20]: Neural TubeDefects (Daño/defecto en el tubo neural)

Comentario [C21]: Prostaglandinas ¿?

Comentario [C22]: Fetal bovineserum. Suero bovino fetal

Comentario [C23]: Epidermal growfactor

Comentario [C24]: Generación decélulas gliales. Formación de células glialesespecíficas de soporte.

3A, B). Se ha confirmado que estos miRNAs se expresan en células madre neurales, cuantificándoseposteriormente los niveles de expresión mediante real time RT-PCR en células madre neurales. Los niveles deexpresión de miRNA MMU-miR-200a (0,009 + / - 0,009) vs 1,06 + / - 0,45 pliegues, p <0,05), MMU-mir-200b(0,021 + / - 0,02 vs 1,04 + / - 0,37 pliegues, p <0,05), mMU-miR-466a-3p (0054 + / - 0,01 vs 1,01 + / - 0,21pliegues, p <0,05) y la MMU-mir-466d-3p (0,028 + / - 0,02 vs 1,01 + / - 0,21-pliegues, p <0,01) se redujosignificativamente en células madre neurales de embarazo con diabetes en comparación con los del control (Fig.3C). En células madres neurales de embarazo con diabetes, el aumento significativo en la expresión de proteínasde Dcx y Pafah1b1 correlaciona bien con la reducción de la expresión de miRNAs (mMU-miR-200a, mMU-mir-200b, mMU-miR-466a -3p y mMU-mir-466d-3p) (Figs. 2B y 3C) que se han pronosticado para target Dcxy PAFAH1B1 sugiriendo un posible papel del miRNA en la regulación de la expresión génica.Dado que la hiperglucemia aumenta la neurogénesis de las células madres neuronales, se analizó la expresión demiR-124, que ha sido ampliamente demostrado para promover la neurogénesis. La expresión de la mmu-miR-124 se incrementó significativamente en células madre neurales de embarazo diabético (8,83 + / - 2,77 vs 1,00 +/ - 0,40-pliegues, p <0,05) en comparación con el control (Fig. 3D). El aumento de la expresión de miR-124 secorrelacionó con el aumento de la neurogénesis en células madre neurales del embarazo diabético (Figs. 3D y2M).

Validación de target miRNA-mRNA confirma la predicción del targetSe le realizó la pérdida de la función a un miRNA de estudio con el fin de validar las interacciones entre losgenes miARN-mRNA previstos, ya que la expresión de miRNAs seleccionados fue significativamentedownregulated en células madres neuronales del embarazo diabético. El miRNA individual fue eliminado decélulas madres neuronales aisladas de embarazo normal usando inhibidores miRCURY LNA miR. Laexpresión de las proteínas dianas (Dcx y Pafah1b1) se analizaron por Western Blot 40 h post miRNAknockwdown (Fig. 4A). El knockdown de miRNAs, MMU-miR-200a, o MMU-mir-200b o MMU-miR-466a-3po MMU-mir-466d-3p resultó en una mayor expresión en DCX (1,78 / - 0,57 pliegues , p <0,05; 1,42 / - 0,34-pliegues, p <0,05; 2,12 / - 0,40-pliegues, p <0,05; 2,98 / - 1,05 - pliegues, p <0,05, respectivamente) (Fig. 4B) yPafah1b1 (1,93 / - 0,43-pliegues, p <0,05; 1,69 / - 0,57-pliegues, p <0,05 ; 1,64 / - 0,45-pliegues, p <0,05; 1,68 /- 0,34-pliegues, p <0,01, respectivamente) (Fig. 4C) de las proteínas en células madre neurales.

miRNA Derribo Aumenta gliogénesis y neurogénesis en NSCs

Dado que se observó aumento de la expresión de las proteínas implicadas en la neurogénesis y la migraciónneuronal después de la caída de los miRNAs en NSC, se analizó el papel de los miRNAs en la determinacióndel destino NSC. miRNAs, MMU-miR-200a, MMU-mir-200b, MMU-miR-466a-3p y MMU-mir-466d-3pfueron derribados individualmente en células madre neurales en cultivo. Tras caída de miRNAs, ladiferenciación se indujo y las poblaciones de linaje neuronal y glial se estimó por análisis inmunocitoquímico.

Había aumentado significativamente astrogenesis como se indica por el aumento de las células GFAP positivastras caída de miRNAs, MMU-miR-200a (120,52 ± 6,54%, p <0,01) o MMU-mir-200b (115 ± 2,24%, p <0,01) ommu -miR-466a-3p (126,53 ± 18,87%, p <0,05) en comparación con revueltos (SCR) células transfectadas ( .Fig. 5 A-E, i). Del mismo modo, la caída de los miRNA MMU-mir-200b (128,09 ± 10,46%, p <0,05) o MMU-mir-466d (116,05 ± 6,19%, p <0.05) se incrementó el número de NG2 células positivas en comparación con lascélulas transfectadas revueltos ( . Fig. 5F-J , II). Derribo de sólo MMU-miR-200a (135,25 ± 19,34%, p <0,05) oMMU-miR-466a-3p (121.54 ± 17.29%, p <0.05) se incrementó significativamente el número de Map2 célulaspositivas en comparación con revueltos células transfectadas ( Fig. 5K-O , iii), lo que significa un aumentoneurogénesis.

DISCUSIÓN

La diabetes materna se ha demostrado para alterar la expresión de genes implicados en la neurogénesis, lamigración neuronal, y la diferenciación de células madre neurales, que conduce a defectos del tubo neural . Sinembargo, el mecanismo exacto detrás de la desregulación de los genes que conducen a defectos del cerebro noestá claro. Durante mucho tiempo se ha argumentado que los mecanismos epigenéticos están implicados en lamodulación de los patrones de la expresión de múltiples genes que están implicados en alteraciones delneurodesarrollo en los hijos de la gestación diabética. Aunque el manejo de la diabetes durante el embarazo seha reducido la incidencia de malformaciones congénitas en gran medida, se ha demostrado que los bebés demadres diabéticas a desarrollar déficits neuropsicológicos [32] . Analizando embriones fenotípicamentenormales puede ser esencial en la comprensión de los detalles moleculares detrás de la aparición de déficitsneuropsicológicos en los hijos de madres diabéticas. El presente estudio muestra claramente que lahiperglucemia activa los mecanismos epigenéticos que resultan en la expresión génica alterada en células madreneurales derivadas de embarazo diabética y se cultivaron en un medio de PG.

Embalaje Cromatina es controlada por modificaciones de las histonas reversibles y los patrones de metilacióndel ADN y determina la accesibilidad y disponibilidad de ADN para la transcripción a través de acetilaciónespecífica o marcas de metilación de la histona.Heterocromatina regiones que regulan la expresión génicamediante la adición o eliminación de marcas de silenciamiento de genes , se sabe que presentar en la periferianuclear tal como se revela en el análisis de TEM. Entre la metilación de histonas lisina, H3K9me3 residuos seha demostrado que se asocia con los promotores de genes que son reprimidos transcripcionalmente y es másabundante en las regiones de heterocromatina . Niveles altos de glucosa ha sido reportado para alterar laexpresión de genes por metilación o acetilación de residuos de lisina en la histona H3 . Tomados en conjunto, elaumento mundial H3K9me3 y disminuyó H3K9ac observó en células madre neurales de embarazo y NSCdiabética expuesto a HG in vitro indican que las enzimas modificadoras de histonas están posiblementeactivados por la hiperglucemia, lo que resulta en la expresión génica alterada. Además, el ensayo de metilaciónmundial reveló aumento de la metilación del ADN en células madre neurales del embarazo y el NSC expuestosa HG diabética in vitro . El aumento de la metilación del ADN puede ser responsable de la expresión génicaaberrante (posiblemente debido a la hipermetilación del ADN en los promotores de genes) en células madreneurales de embarazo y NSC expuestos a HG diabética in vitro . Aunque no se encontraron niveles globales demetilación del ADN a ser incrementado, la regulación positiva de PAFAH1B1 la expresión génica en célulasmadre neurales de embarazo y NSC expuestos a HG diabética in vitro no era debido a los cambios en lametilación de CpG.

La neurogénesis y migración neuronal son acontecimientos clave que controlan el desarrollo adecuado delcerebro. Neurogénesis defectuosa o resultados de la migración neuronal en las anormalidadescerebrales [36, 37] . Para entender el papel de la hiperglicemia en la especificación del destino de expresiónNSC, se han analizado la expresión de dos genes (Dcx y PAFAH1B1) implicados en la neurogénesis y lamigración neuronal [37 - 39] . Tanto DCX y PAFAH1B1 resultaron de manera significativa, alterados en eltejido cerebral de embriones de ratones diabéticos por nuestros anteriores estudios de microarrays. Dcx seexpresa mediante la migración de los precursores neuronales [40] y las funciones de genes rio arribaPAFAH1B1 durante la migración neuronal [41] . Además, PAFAH1B1 se requiere para la orientación exacta dehusillo (y por lo tanto la proliferación) en las células madre neuroepiteliales y células progenitoras glialesradiales [42] . Upregulation o regulación a la baja de PAFAH1B1 o Dcx ha sido demostrado que afecta eldesarrollo del cerebro. Disminución de la expresión de DCX y / o PAFAH1B1 contribuye a Lisencefalia que secaracteriza por " apariencia de cerebro liso" [43] . El aumento de expresión de DCX inhibe la proliferación ypromueve la migración de células progenitoras neurales humanas [44] . El aumento de expresión de

Comentario [N25]: Aquellas palabrasque se encuentran en amarillo, no las pudeencontrar.

Comentario [N26]: literalmentesignifica "cerebro liso", trastorno pococomún de la formación del cerebrocaracterizado por microcefalia y agiria, quees una ausencia de las circunvoluciones opliegues normales del cerebro. Es causadapor una migración neuronal defectuosa, elproceso en el cual las células nerviosas sedesplazan desde el lugar de origen a sulocalización permanente

PAFAH1B1 se ha demostrado que afecta el desarrollo del cerebro incluyendo el tamaño y la organizacióncelular en los seres humanos y ratones [45] . En el presente estudio, un incremento en la expresión de DCX,PAFAH1B1 proteínas en las células madre neurales (NSCs) de embarazo diabético parece estar asociada con elaumento de la neurogénesis. Parece que la hiperglicemia promueve neurogénesis a costa de la gliogénesis yaque los niveles de expresión de GFAP y Ng2, marcadores de astrocitos y oligodendrocitos, respectivamente, seencontró que fueron disminuidas en células madre neurales de embarazo diabético. La disminución de laexpresión de marcadores gliales en NSC expuestos a la hiperglicemia también podría ser debido al hecho de quela gliogénesis se ha demostrado que esta precedida por neurogénesis en la corteza en desarrollo [46] . Aunqueno hubo un cambio en el patrón de diferenciación de células madre neurales (NSCs) a partir de embriones decontrol y embarazo diabético en diferentes puntos de tiempo (3 días y 6 días de diferenciación), la posibilidadde gliogenesis retardada no puede ser excluida desde NSCs, ya que fueron aisladas de una sola etapaembrionaria ( E113.5) en este estudio. En general, se sugiere que la hiperglicemia perturba la elección deldestino celular entre las neuronas y la glía. No está claro lo que mueve el interruptor glía-neurona-hiperglicemiainducida, aunque varios genes parecen estar implicados.

Es bien sabido que los miRNAs regulan la expresión génica a través de la unión a secuencias 3'UTR que causanla represión o la degradación de los mRNAs diana. miR-200 de la familia ha sido reportado para regular laneurogénesis olfativa en modelos de ratón y pez-cebra [47] y la expresión de los algunos miembros de la familiamiR-466 se ha demostrado en el tejido ocular de ratón [48] . Este estudio es el primero en reportar la expresiónde miRNAs MMU-miR-200a, MMU-mir-200b, MMU-miR-466a-3p y MMU-mir-466 d-3p en NSCs obtenidosde embriones de ratón del cerebro anterior. Además, confirmamos que Dcx y PAFAH1B1 fueron blanco demiRNAs MMU-miR-200a, MMU-mir-200b, y MMU-miR-466a-3p y MMU-mir-466d-3p mediante enfoquecaída (knockdown). miR-124 se expresa abundantemente en el cerebro de ratón [49] , específicamente en lasneuronas y su expresión es encontrado que aumentar durante el desarrollo[50 - 52] . Varios estudios handemostrado el papel de miR-124 en la promoción de la neurogénesis y la diferenciación neuronal [52- 55] . Enel presente estudio, el aumento de la neurogénesis observó una correlación con el aumento de expresión demiRNA neurona específica, miR-124.

Recientemente se ha demostrado miRNAs para promover y regular la especificación de linaje de células deratón y células humanas [56] . Desde knockdown de miRNAs específicos aumenta la expresión de las proteínasimplicadas en la neurogénesis y la migración neuronal, que hemos examinado su papel en la determinación deldestino en NSC .Presentamos nuevo papel de miRNAs MMU-miR-200a, MMU-mir-200b, MMU-miR-466a-3py MMU-mir-466d-3p en la regulación de la neurogénesis y gliogenesis in vitro por la focalización y regulaciónal alza de GFAP, proteínas Map2 y Ng2 ya sea a través de blanco directo o a través de una regulación indirectaque requiere una evaluación detallada. Dado que cada uno de los miRNAs son reportados para contener cientosde mRNA objetivos ( miRwalk base de datos), es posible que muchas de los objetivos estén involucrados eneste complejo proceso de la determinación del destino NSC. Alterado destino de NSC debido a la expresióndiferencial de los genes miARN inducida por la hiperglucemia puede explicar el fundamento de defectos delpatrón observado en el desarrollo del cerebro expuesto a la diabetes materna.

En conclusión, este estudio demuestra que los mecanismos epigenéticos se activan en células madre neurales(NSCs) por la hiperglicemia, que resulta en la reorganización de la cromatina, alterando el estado de la histonaH3K9, el aumento de la metilación del ADN a nivel mundial, y la expresión alterada de los genes miARNpromoviendo así el aumento de la expresión de marcadores de linaje neuronal y glial. Este estudio esclínicamente relevante debido al hecho de que los cambios epigenéticos son persistentes, incluso cuando NSCsde embarazo diabético se cultivaron en normoglicemia y células madre neurales (NSCs) de embriones nomalformados son sensibles a la glucotoxicidad lo que sugiere que los embriones fenotípicamente normales son

genotípicamente distinta y deficiente. Dado que los cambios epigenéticos son reversibles, usándolos comodianas terapéuticas puede mejorar los resultados fetales en el embarazo diabético.

>>>PIES DE IMÁGENES<<< .

Figura 1. La hiperglucemia modifica mecanismos epigenéticos en NSCs. (A-C) Representante por microscopíaelectrónica de transmisión de imágenes NSCs de control.A), que están expuestos a altos niveles de glucosa (HG) in vitro(B) y de gestación diabética (C). Estructura de heterocromatina aumentada en la periferia nuclear fue observada en NSCsespuestos a altos niveles de glucosa y a gestación diabética.(flechas blancas). Barra representa 1 milímetros. (Ampliación:13.500 ). (D, E) El porcentaje de H3K9me3 (D) fue significativamente mayor en NSCs expuestos a HG in vitro (barrasnegras) que de gestación diabética ( barras abiertas) cuando se comparan con el control ( barras grises) mientras elporcentaje de H3K9ac(E) fue significativamente más disminuido en NSCs expuestos a HG in vitro ( barras negras) que degestación diabética cuando se comparan con el control ( barras negras). (F) Incremento en el porcentaje de metilación delDNA fue observado en NSCs expuestos a HG in vitro fue mayor si se comparan con el control. La barra representa elpromedio de 6 SD por lo menos 4 experiencias independientes, * p,0.05.

Figura 2: incrementada la expresión de Dcx y Pafah1b1 y neurogenesis en NSCs de gestación diabética. (A) Laexpresión de mRNA de Dcx y Pafah1b1 aumentó significativamente en NSCs de gestación diabética comparados con elcontrol. (B,C) La expresión y cantidades de proteínas Dcx y Pafah1b1 en NSCs de control y gestación diabética fueronestimados por Western blot (B) blot representativo muestra la expresión de proteínas Dcx y Pafah1b1 en NSCsprocedentes de embriones en control de gestación diabética. (C)Las cantidades de proteínas Dcx y Pafah1b1incrementaron significativamente en NSCs provenientes de embriones de la gestación diabética ( barras abiertas) encomparación con el control. (D) mRNA de Dcx y Pafah1b1 aumentaron significativamente en NSCs expuestos a HG invitro cuando se comparan con el control.(E-L)Las neuroesferas procedentes de embriones de control diabético y elembarazo se permite diferenciar por 3 días in vitro y la expresión de neuronas (Map2), glial (Gfap, Ng2),y las poblacionesde células positivas Nestin se determinaron mediante inmunocitoquímica. (M) El porcentaje de células positivas Mapa2fue significativamenteaumentado, mientras que los porcentajes de Gfa y Ng2 células positivas se redujeronsignificativamente en CSN de la gestación diabética (barras abiertas) en ambos 3 díaso 6 días post diferenciación conrespecto al control (barras cerradas). Los datos están representados como media 6 SD de por lo menos cuatro ensayosindependientes)

Figura 3: Expresion de miRNA es alterada en NSCs de gestaciion de diabetes. (A,B) Hibridación in situ revelaexpresión de miRNAs mmu-miR-200b (A) y mmu-miR-466d-3p (B) en NSCs. El núcleo está contrateñido con DAPI(azul).(C) El análisis de la expresión del miRNA reveló una disminución de la expresión del miRNAs mmumiR-200a,mmu-miR-200b, mmu-miR-466a-3p y mmu-miR-466d-3p en NSCs de gestación de diabetes cuando se comparan con elcontrol. La expresión de los genes miARN neurona específica, miR-124 fue significativamente aumentado en NSCs degestación de diabetes cuando se comparan con el control.

Figura 4.- la pérdida de la función de los genes miARN confirma Dcx y PAFAH1B1 como objetivos. (A)Representante de Western blot que muestra la expresión de proteínas dcxPAFAH1B1 expresión después de la caída demiRNAs específicos en células madre neurales. (B, C) Las cantidades de Dcx (B) y las proteínas PAFAH1B1 (C)aumentaron significativamente en NSCs tras caída de MMU-miR-200a o MMU-mir-200b o MMU-miR-466a-3p o MMU-mir-466d-3p en comparación con las células transfectadas

Figura 5. miRNAs regulan NSC destino. Se ensayó el efecto de la caída en los genes miARN NSC destino. miRNAsespecíficos fueron derribados en el NSC y el porcentaje de GFAP, Ng2 o Map2 células positivas se cuantificaron encélulas diferenciadas. Confocal de imágenes que muestran la expresión de células GFAP positivas (A-E),células NG2positivas (F-J) y Map2 células positivas (K-O) (rojo) en células diferenciadas seguidos de caidas de miRNAs MMU-miR-200a o mmumiR-200b o MMU-miR-466a-3p o MMU-mir-466d-3p en NSCs. El análisis cuantitativo muestra elporcentaje de células positivas para GFAP (i), NG2 células positivas(ii) y Map2 células positivas (iii) seguidos de caidasde miRNAs específicos.