2.- metodos diagnosticos en la medicina personalizada de … · mide el perfil de expresión...

2.- METODOS DIAGNOSTICOS EN LA MEDICINA PERSONALIZADA DE

PRECISIÓN.

Profa. Mª Dolores ludeña de la Cruz.

Catedrática y Jefa del Servicio de Anatomía patológica

Complejo Asistencial Universitario de Salamanca

Universidad de Salamanca

TIPOS DE MUESTRAS CITOLOGÍAS: extensiones citológicas. Líquidos PUNCIONES: Extensiones citológica /bloque de parafina BIOPSIAS: endoscópicas, piezas quirurgicas… AUTOPSIAS Técnicas limitadas por el material.

IHQ: Anticuerpos: Expresión proteica FISH: Translocaciónes del gen ALK, fusiones ROS1, amplificaciones: Cerb2…. PCR: Mutaciónes: EGFR, KRAS,NRAS, BRAF CKIT, MGMT…, Secuenciación: Pirosecuenciación PAM50-Based Prosigna Breast Cancer Assay nCounter NanoString

Diagnostico: protocolos (CAP, OMS, guias SEAP…)

METODOS DIAGNOSTICOS EN LA MEDICINA PERSONALIZADA DE PRECISIÓN

SOY UN CELULA TUMORAL

FIJACIÓN TALLADO

INCLUSION

CORTE 3 MICRAS

TINCIÓN

MONTAJE

VISUALIZACIÓN EN EL MICROSCOPIO

PULMON (LOBECTOMIA SUPERIOR IZQUIERDA): ADENOCARCINOMA DE TIPO PAPILAR. IHQ: TTF1+; CK7+; NAPSINA+; P40-; CK5- TAMAÑO: 4,5 CM. LOCALIZACIÓN: DISTAL SUBPLEURAL HILIO: LIBRE. 3 GANGLIOS HILIARES REACTIVOS Y ANTRACÓTICOS PLEURA: PL1: INFILTRACIÓN DE ELASTICA INTERNA ESTUDIO MUTACIONAL DE EGFR (PCR): NATIVO TRANSLOCACION DE ALK (FIHS): TRASLOCACIÓN ROS (FIHS) : No fusión Her2 (FIHS): no amplificación

IHQ (INMUNOHISTOQUIMICA)


• CPNM: – P63/P40+: CE

– CK5+: CE

– CK7+:ADC

– TTF1+:ADC

– Napsina+: ADC

• CPM: – Pancitoqueratina+ (CAM5.2)

– Sinaptofisina+

– Cromgranina+

– CD 56+

– ALC -(dd Linfomas)

CK5

P63/ P40

TTF1

Napsina

Consiste en la visualización de la expresión proteica utilizando Anticuerpos y marcándolos con un cromógeno.

CARCINOMA ESCAMOSO


H-E

• CPNM: – P40+: CE

– CK5+: CE

– CK7+:ADC

– TTF1+:ADC

– Napsina+: ADC

• CPM: – Pancitoqueratina+ (CAM5.2)

– Sinaptofisina+

– Cromgranina+

– ALC-

Napsina A

P63/P40

ADENOCARCINOMA


TTF1

Sinaptofisina

CD56

• CPNM: – P40 +: CE

– CK5+: CE

– CK7+:ADC

– TTF1+:ADC

– Napsina+: ADC

• CPM: – Pancitoqueratina +(CAM5.2).

CK8/18 +

– Sinaptofisina+

– Cromgranina+

– CD56+

– ALC -

CAM5.2

CA. NEUROENDOCRINO


CDX2 TTF1

• 1º O METASTASIS??? – ADC COLON: CK20 +;CDX2+

– ADC PULMÓN: CK7+, TTF1+

CK7

TTF1

METASTASIS ADC COLON

ADC PRIMARIO PULMONAR

CK20


• 1º O METASTASIS??? – CA CELS CLARAS (RENAL):

– CD10+:

– VIMENTINA+

CD10

Vimentina


METASTASIS CARCINOMA RENAL

Vía PD1/PD-L1. INMUNOTERAPIA

PD-1 ("Programmed Death-1“), es una proteína transmembrana (familia de inmunoreceptores CD 28) que se encuentra en los LB, LT y NK, participando en la respuesta inmune.

Su ligando PD-L1 está implicado en la evitación

de fenómenos de autoinmunidad.

El cáncer de pulmón utiliza esta vía inhibitoria del

sistema inmune como forma de escape de los sistemas

naturales de defensa.

La inmunoterapia actúa bloqueando el eje PD-1/PD-L1 restaurando la inmunidad del huésped contra los tumores.

La técnica de IHQ para PD-L1 clon 22C3 procesador automático a partir secciones

de 3 micras de bloques parafinados de las muestras.

PULMÓN: Células Tumorales (CT): Determinación de la viabilidad de la muestra: >100 células

tumorales. Análisis semicuantitativo. Valorar: % de células que expresan PDL1. Intensidad (de 1+a 3+) y patrón: homogénea

/ heterogénea. Células Inmunes: Evaluación de la expresión en células inflamatorias (linfocitos y

macrófagos). CT:+>50% ADC CI: - ADC CT: +>50% CE CT: - y CI: + ADC

Protocolo: PD-L1 22C3 pharmDx. Dako

VENTAJAS: •Es una técnica habitual en los laboratorios de AP (aprox. 120 técnicas diarias). •Es fundamental para el diagnostico: marcador de estirpe celular, pronostico…. •Citologías y biopsias (Parafina): Cortes de 3 micras. Se puede realizar en muestras de archivos. •Microscopio óptico. •Se archivan y se mantien bien durante años. INCONVENIENTES: •Ninguno

INMUNOHISTOQUÍMICA:

FISH (HIBRIDACIÓN IN SITU CON FLUORESCENCIA)


Empleo de sondas con fluorescencia que reconoce secuencias específicas de 1. Genes: Detecta anomalías genéticas (y numéricas), etc… 2. Cromosomas: Detecta alteraciones cuantitativas

FISH: HIBRIDACIÓN IN SITU CON FLUORESCENCIA

CISH: EMPLEO DE CROMÓGENO EN LUGAR DE FLUOROCROMOS


Erb2: Ca mama. Amplificación ALK: Ca pulmón. Translocación Ros: Ca pulmón. Fusión Requiere tener material en parafina. Cortes de 3 micras

VENTAJAS: •Aplicable a material parafinado •Correlación entre morfología y anomalías genéticas

INCONVENIENTES: •Sólo detecta anomalías de sondas que estudiamos. •Pueden existir FP y FN si valorado por técnicos u otros profesionales no patólogos. Dificultad en identificar las células tumorales.

•MULTICOLOR

FISH:

PCR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA


• Inicialmente desarrollada para investigación

•Herramienta diagnóstica complementaria al estudio

histopatológico convencional.


-Reacción química por cambios cíclicos en temperatura.

- Amplificación específica y exponencial de pequeñas cantidades de material genético en

poco tiempo

TERMOCICLADOR


MUTACIÓN

INVESTIGACIÓN

MICROORGANISMOS SECUENCIACIÓN

CLONALIDAD

AMPLICON

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:PCR_es.svg

Selección de CÉLULAS tumorales para extraer DNA: citología, punción o biopsia.

NO NECESITAMOS CORTE HISTOLÓGICO


También en biopsia liquida: extracción de DNA del plasma

Las muestras son introducidas en un extractor de ADN automático, el cual realiza la función de extracción y purificación del ADN mediante columnas.

Este dura aproximadamente1 hora con una capacidad de 12 muestras.


Se prepara la placa siguiendo el protocolo suministrado por la casa comercial del kit. Muestra

standard

Control negativo

Muestras problema

Mezcla control ct

Se introduce en el aparato de PCR a tiempo real.


Al final del proceso aparecen las gráficas de las diferentes muestras que son valoradas por el patólogo, o Report con los resultados ya analizados. No se necesita microscopio.


VENTAJAS: •Método rápido y relativamente barato •Alta sensibilidad INCONVENIENTES: •Alta sensibilidad: Falsos positivos por contaminación. •DNA de mala calidad / factores inhibidores: falsos negativos ¿PARA QUE LE SIRVE AL PATÓLOGO?: DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN CANCER: Mutaciones de EGFR,

KRAS, BRAF, NRAS, CKIT, PI3K… DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS: Bacterias (micobacterias). Hongos. Protozoos. Virus. CLONALIDAD LINFOIDE

PCR:

SECUENCIACIÓN


Conjunto de métodos y técnicas bioquímicas para determinar el orden de los nucleótidos.


SECUENCIACIÓN:

VENTAJAS: •Permite identificar nuevas alteraciones moleculares y eventos oncogénicos. INCONVENIENTES: •Cara y laboriosa. •Complejidad técnica

PIROSECUENCIACIÓN:

Tecnología de secuenciación mediante luminiscencia. Sistema de Sanger: resuelve 67.000 bases cada hora Pirosecuenciación: 20 millones en 4,5 horas Abarata enormemente el coste del proceso. MGMT, CKIT…

MGMT CKIT

SECUENCIACIÓN MASIVA:

Tecnología que permite secuenciar masivamente un gran número de genes de un determinado paciente por un coste reducido.

PAM50-Based Prosigna Breast Cancer Assay. Prueba Prosigna® de firma genética para el pronóstico del cáncer de mama Mide el perfil de expresión génica de RNA del tumor que junto con una serie de variables clínicas nos clasifica el tumor en subtipos subtipo (luminal A, luminal B, HER2 enriquecido o de tipo basal) y una puntuación que indica la probabilidad de recurrencia a distancia de la enfermedad.

TEST GENÓMICO DE MAMA

The nCounter platform (NanoString Technologies): Lector digital de moleculas de mRNA de forma individual

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nCounter DNA SNV Solid Tumor Panel

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Paneles de Fusión Génica NanoString ALK /RET/ ROS/ NTRK1

MICRODISECCIÓN

-Método no molecular para seleccionar células morfológicamente diferentes en muestras heterogéneas. -Microscopio óptico con láser.


TIPOS: a) Captura con láser infrarrojo: funde una membrana termoplástica pegada al tejido


b) Microdisección por corte con láser ultravioleta que corta el tejido. En algunos modelos el propio laser lo catapulta a tubos de colección.

VENTAJAS: •Seleccionar células de muestras heterogéneas •Rápida y precisa •Material parafinado •Estudios DNA, RNA, proteinas INCONVENIENTES: •Técnica cara •Muy laboriosa •Imprescindible que el patólogo esté presente para seleccionar el material por la dificultad de identificar células APLICACIONES: Investigación

c) Microdisección Manual con agujas

TMA (TISSUE MICROARRAYS)


Técnica que permite evaluar de una sola vez centenares de muestras de tejido, tanto sus características imunohistoquímicas como moleculares: FISH.


4 3

2 1

TMA

40 PREPARACIONES

CONVENCIONAL

3.200 PREPARACIONES

75 muestras x 40 anticuerpos

Ahorro


TISSUE MICROARRAYS:

VENTAJAS: •Metodología estandarizada pudiendo estudiar muchas muestras a la vez con diferentes técnicas. •Disminución de variabilidad inter-ensayo • IHQ. FISH •Estudios en archivos históricos de muestras.

INCONVENIENTES: •Muy laboriosa. •Dudas sobre representatividad de la lesión: tumores genéticamente heterogéneos.

•Las muestras obtenidas para diagnostico

Patológico (biopsias, punciones y

citologías), son válidas para el diagnostico

y para la determinación de las

alteraciones moleculares (medicina

personalizada).

•Colaboración:

•Otros servicios

•Centros de referencia

•Centros de investigación


2.- metodos diagnosticos en la medicina personalizada de … · mide el perfil de expresión...

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