FIJACIÓNLa fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima. Fijación de la muestra.Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan para tal fin.

Cualidades que debe tener un fijador:1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis, desintegración, etc.).2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar.3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.).5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella.6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

                                                                                                                                                            

FIJACION DE LA MUESTRA

Clases de fijadoresExisten muchas clases de sustancias fijadoras. Una clasificación de los diferentes tipos de fijadores es la propuesta por Backer (1960):Aldehidos. Son algunos ejemplos: el paraformaldehido, el glutaraldehido, la acroleina y el glioxilato Agentes oxidantes. Los más utilizados: el tetróxido de osmio, el permanganato potásico y el dicromato potásico. Agentes desnaturalizantes de proteinas. Algunos ejemplos: el ácido acético, el alcohol metílico y el alcohol etílico Fijadores que actúan por mecanismos poco conocidos. Pertenecen a este grupo el ácido pícrico y el cloruro de mercurio.

Cómo se elige un fijadorLa decisión de emplear un fijador u otro es siempre función del tipo de estudio histológico que deba realizarse. Existen soluciones fijadoras que son más adecuadas que otras para cada tipo de procesamiento y estudio. Distinguimos entonces:Fijación para microscopía óptica Fijación para microscopía electrónica Fijación para estudios topográficos o morfológicos Fijación para demostración de productos específicos Fijación para estudios histoquímicos Fijación para estudios inmunocitoquímicos Los métodos físicos de fijación más empleados son:Fijación por calor Fijación por microondas

Forma de actuar de los fijadoresVaría con la composición o naturaleza de los mismos: coagulando las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración ulterior de los tejidos (en su mayoría, son reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molécula de hidrógeno con su cromóforo).

Fijadores químicosSon los más utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitución.FIJADORES SIMPLES:a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien estructuras celulares.e) Bicromato de potasio al 3-5%.

FIJADORES COMPUESTOS:En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos.a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico.

FIJADORES FÍSICOS:1. Desecación. 2. Calor seco.3. Calor húmedo.4. Frío.5. Congelación y desecación.

Los métodos químicos de fijación más empleados son:Fijación por inmersión. Este método consiste en tomar o extraer una muestra del tejido u órgano que se vaya a procesar y sumergirlo en una solución fijadora. Normalmente, se introduce la pieza de tejido en un frasco que contiene la cantidad adecuada de fijador. Fijación por vapores. Este método consiste en exponer la muestra que se pretenda fijar a la acción de los vapores del fijador. Fijación por perfusión. Este método consiste en realizar una perfusión de la solución fijadora utilizando el torrente vascular. Es el método empleado normalmente con animales de experimentación en los que se practica una perfusión cardiaca o aórtica. Con la utilización de este método se consiguen las mejores fijaciones (y por lo tanto las mejores observaciones histológicas) puesto que: Se facilita el proceso de penetración del fijador al interior de las muestras. Se evita la deformación del tejido durante la manipulación de extracción preservándose mejor la estructura de los tejidos blandos. El proceso de fijación comienza inmediatamente y se ha comprobado que de esta forma el número de células picnóticas que se observa en los tejidos es menor que utilizando otros métodos de fijación. También se ha observado que el número de mitosis observado es mayor que utilizando otros métodos. Tras la perfusión, usualmente se completa el proceso de fijación disecando las piezas objeto de estudio y fijándolas seguidamente por inmersión. En ocasiones, pueden combinarse los métodos físicos y los químicos ya sea secuencialmente o simultáneamente. Por ejemplo se puede fijar con microondas una pieza sumergida en un fijador químico.

Propiedades de los fijadores Mecanismos de Fijación Los mecanismos de acción de ciertos fijadores son poco conocidos. Es el caso de los fijadores basados en el uso de sales de mercurio. La mayor parte de los fijadores establecen entrecruzamientos con proteínas solubles y estructurales formándose, como consecuencia, un gel que mantiene una estructuración muy parecida a la observada in vivo Algunos fijadores interaccionan con los ácidos nucleicos. Fijación de las proteínas Formaldehido: entrecruzamiento con aminoácidos externos (especialmente con la lisina). Reacciones reversibles durante las primeras 24 horas. Preserva bastante tanto la capacidad antigénica como la actividad enzimática. La morfología suele ser óptima pero la ultraestructura puede ser deficiente.Glutaraldehido: formación de polímeros que establecen entrecruzamientos con las proteínas. Con el paso del tiempo los polímeros se van uniendo entre sí. Reacciones rápidas e irreversibles. Puede inhibir tanto la actividad enzimática como la capacidad antigénica. Se obtiene una muy buena preservación ultraestructural.

Factores implicados en la fijación 1. Concentración del fijadorLa capacidad de fijación de la solución fijadora que empleemos vendrá determinada por la concentración del fijador utilizado. A mayor concentración mayor fijación. Sin embargo conviene elegir la concentración adecuada para impedir que la interacción del fijador con el tejido (efecto barrera) sea un impedimento para la entrada del fijador hacia la parte central de la muestra.Concentraciones muy elevadas del fijador pueden provocar malas fijacionesEl formol comercial (35%) se utiliza normalmente diluyéndolo 10 veces para preparar la formalina.El paraformaldehido suele utilizarse en concentraciones del 2 al 4%El glutaraldehido (que se comercializa al 25%) puede utilizarse a concentración entre el 0,1 y 2,5 %2. Tampón y pH Pueden utilizarse los fijadores en soluciones acuosas, pero para trabajos más finos es necesario que el vehículo esté tamponado a un pH determinado (en función del tipo de tejido o de la actividad enzimática que se desea determinar).La morfología y ultraestructura se mantienen aceptables dentro de un margen de pH de 6 a 8. Para tejido nervioso se recomienda generalmente un pH de 7.4

Tampones más utilizadosEl tampón fosfato, el tampón cacodilato, o el tampón veronal Hay ciertas precauciones que hay que tener en cuenta:

Evitar interacciones entre el fijador y el tampón (Por ejemplo: el tampón tris y los barbituratos reaccionan con los aldehidos) Algunos tampones inhiben ciertas actividades enzimáticas mientras que otros las favorecen (Por ejemplo: el tampón fosfato inhibe la glucosa 6'-fosfato deshidrogenasa; el tampón trizma-maleato favorece la determinación enzimática de las fosfatasas)

TemperaturaPara muchos de los estudios que se realizan en Microscopía óptica las fijaciones suelen realizarse a temperatura ambiente. Sin embargo, para estudios Histoquímicos o Inmunocitoquímicos o cuando el objetivo es realizar un estudio en Microscopía electrónica, las fijaciones conviene realizarlas en nevera a temperatura de 0-4 grados C.En general, incrementando la temperatura, se acelera el proceso de fijación. Cuando se utilizan bajas temperaturas, hay que aumentar los tiempos de fijación.

Penetración de los Fijadores Cada fijador tiene un coeficiente de difusión intrínseco que indica el grado de penetración que posee, expresado en milímetros por hora. Para facilitar la penetración de los fijadores, se han de retirar todos los obstáculos que impidan su penetración (Por ejemplo, para fijar el cerebro hay que retirar las meninges).Para facilitar la fijación, las muestras se han de trocear en rebanadas lo más delgadas posibles: Para microscopía óptica, son suficientes rebanadas de 5 mm. de grosor. Para microscopía electrónica se recomienda que estas rebanadas tengan un grosor menor a 1 mm.VolumenPara asegurarnos buenas fijaciones por inmersión es necesario que el volumen del fijador exceda en una proporción de 10:1 el volumen de las muestras.Es conveniente cambiar el fijador una o varias veces a lo largo de la fijación.Osmolaridad Es importante ajustar la presión osmótica de la solución fijadora. Si la solución fijadora es isotónica (340 mOsm) o hipotónica, se produce vacuolización celular. Si la solución fijadora es muy hipertónica se produce una contracción del tejido con retracción celular.Los mejores resultados se consiguen con una solución ligeramente hipertónica de 400 - 450 mOsm.

Para ajustar la la osmolaridad de las soluciones fijadoras se recurre a la adición de determinadas sustancias como: dextranos, polivinilpirrolidona, sucrosa (>5%) o Cloruro sódico (0,9%)Tiempo de Fijación Hay que ajustar cuidadosamente el tiempo de fijación en función del fijador utilizado, de su concentración, de la temperatura y del objetivo del estudio. Una fijación excesiva produce efectos adversos como: Retracción del tejido; endurecimiento excesivo que dificulta la ulterior obtención de cortes; extracción de algunas moléculas; inhibición de actividades enzimáticas; pérdida de características antigénicas; y degradación general del tejido por oxidación de las proteínas. 

Obtención de muestras y proceso histológicoToda muestra, ya sea procedente de una biopsia, una autopsia, o de un trabajo experimental (utilizando animales de experimentación) que deba estudiarse en el laboratorio de Histología debe estar bien identificada desde el principio. Todos los recipientes que la contengan deben estar convenientemente etiquetados con una referencia adecuada.Una vez las muestras han sido convenientemente fijadas se ha de proceder con el desarrollo del proceso histológico adecuado que permitirá la obtención de cortes. En función de las técnicas de tinción que se pretendan emplear y del tipo de estudio que se quiera realizar, las muestras se procesarán de una forma u otra. En ocasiones (cuando se ha de realizar un diagnóstico rápido de una biopsia, o cuando la técnica lo requiere) puede ser necesario o conveniente obtener secciones histológicas sin realizar una fijación previa. En estos casos las muestras se congelan rápidamente y se cortan con un microtomo de congelación En términos generales puede decirse que el proceso histológico pretende dar soporte o endurecer lo suficientemente las muestras para permitir la obtención de cortes delgados.

DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINADeshidrataciónLas piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación creciente. Se dispone una lámina en un cassette de deshidratación. Deshidratación en alcoholes sucesivos.Impregnación por un disolvente de la parafina (aclaración)Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol. Al agregar el xilol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratación no ha sido bien lograda y debemos repetir el baño de alcohol absoluto cerciorándonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de xilol no debe enturbiarlo.

                                                                                                                                                            

Se dispone una lámina en un cassette de deshidratación.

                                                                                                                                                                          

Penetración de la parafinaSe sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina. Penetración de la parafina a 56-58ºC.Inclusión definitiva o formación del bloqueEn moldes de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera. OBTENCIÓN DE CORTESEl objeto de la inclusión que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrótomos son instrumentos de gran precisión que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones.

Deshidratación en alcoholes sucesivos.

                                                                                                                                                            

Penetración de la parafina a 56-58ºC.

                                                                                                                                                            

Barras de Leuckart

Consideraremos cuatro tipos de micrótomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelación, y el crióstato o criótomo.- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guías especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos.- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta. Corte en micrótomo tipo Minot.- Tipo congelación: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelación colocado debajo de la platina que utiliza la expansión brusca del anhídrido carbónico contenido en un cilindro con el cual se comunica.

                                                                                                                                                            

Corte en micrótomo tipo Minot.

- Crióstato: consta de un micrótomo tipo Minot incluido en una cámara de congelación. El volante de inercia que controla la realización del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance están situados dentro de la cámara fría (normalmente a -20º C). Pese a la disposición horizontal de la cuchilla, la obtención de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los modelos más modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, así como enfriar rápidamente la muestra a -60º C gracias a la existencia de una placa de congelación instantánea. Frente al micrótomo convencional de congelación, el crióstato posee la gran ventaja de permitir la obtención de cortes mucho más delgados.

COLORACIÓNLuego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloración.Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos.Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solución colorante.Clasificación de los colorantes:Según su origen se clasifican en:COLORANTES NATURALES:- Animales (carmín)- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán) COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA):- Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmáticos.- Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.- Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.- Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).

CRIOSTATO

Por otro lado, las coloraciones pueden ser:- Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante empleada.- Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente al del colorante empleado. Métodos de coloración:- Coloración directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.- Coloración indirecta: requiere la intervención de intermediarios o mordientes para que la coloración tenga lugar.- Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo.- Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciación.- Coloración simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (núcleo, fibras elásticas, etc.).- Coloración combinada: se tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de colores básicos y ácidos que contrastan por sus colores.- Coloración panóptica: es una coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa).- Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros que se necesiten.

Colorantes más utilizados en histología humana:HEMATOXILINA:- Es un colorante vegetal.- Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposición) u oxidantes artificiales (óxido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potásico, etc.)- Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilínicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solución colorante), comportándose en este caso como un colorante indirecto. EOSINA:- Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos halogenados con tres grupos arilo).- Presenta autofluorescencia espontánea.- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas. Para colorear se emplea generalmente una batería de coloración.

                                                                                                                                                            

Batería de Coloración H&E.

MONTAJELuego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro.La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.La aclaración se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo le confiere un índice de refracción semejante al del vidrio. Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto.Se deja secar unas horas antes de su observación al microscopio.

PROTOCOLO GENERALA continuación se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra cátedra para la técnica de Hematoxilina - Eosína para preparados de uso didáctico:I. Fijación En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs.II. CorteSe le da el tamaño deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el fin de enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'.III. Deshidratación1) Alcohol 70º, 1h30'.2) Alcohol 96º, 1h30'.3) Alcohol 100º (l), 1h30'.4) Alcohol 100º (ll), 1h30'.5) Xilol, entre 1h30' y 3hs.

IV. Inclusión1) Secado de la muestra con gasa.2) Parafina 56º (l), 1h30'.3) Parafina 56º (ll), 1h30'.4) Formación de la barra o bloque.5) 30' de frezzer.6) Fractura del taco V. Corte

VI. Coloración1) Secado de los cortes en estufa a 58ºC, 15'.2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa.3) Xilol o toluol (II), 2'.4) Alcohol 100º, 30".5) Alcohol 96º, 30".6) Alcohol 70º, 30".7) Alcohol 50º, 30".8) Agua destilada, 30".9) Hematoxilina, 1´30".10) Agua corriente, 2´.11) Alcohol 50º, 15".12) Eosina, 30".13) Alcohol 96º, 10".14) Alcohol 100º, 10".15) Xilol, 1´ por lo menos.16) Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.

RECOMENDACIONES ÚTILES- Las técnicas histológicas pertenecen al tipo denominado "técnicas contrarreloj". Si Ud. está apurado no las empiece, déjelas para cuando su trabajo le permita dedicarse solo a esa actividad.- Mantenga su laboratorio en orden, con todos los elementos de vidrio que va a utilizar perfectamente limpios.- Rotule todos los frascos inmediatamente luego de preparar cualquier solución.- Guarde siempre las soluciones en frascos de color caramelo.- Mantenga los recipientes que contienen xilol, toluol y alcohol 100º siempre tapados.- Nunca coloque xilol o toluol en recipientes plásticos porque resultan atacados por estas sustancias.- Si debe trabajar con ácidos hágalo bajo campana. Si se derraman o salpican la piel, lave inmediatamente con abundante agua con bicarbonato de sodio.- Cuando coloree prepare primero todas las soluciones, solo después comience con los pasajes del material.

- Si debe realizar simultáneamente varios procesos de inclusión, confeccione planillas de tiempos para cada uno de los materiales. Esto evitará confusiones.- Controle cuidadosamente los tiempos establecidos para cada técnica. Es muy importante respetarlos para obtener resultados satisfactorios.- Antes de iniciar cualquier técnica, primero léala atentamente. Prepare el material de vidrio necesario, reúna los reactivos y colorantes, haga las diluciones, determine los tiempos, y después comience el proceso.- Tenga mucha paciencia y voluntad. Sea perseverante, si durante las primeras experiencias sus resultados no son lo que Ud. esperaba, verifique cada paso y repita tantas veces como sea necesario.