Cicl o de Conferencias sobre:

IRRADIACION, CONSERVACION Y TRASPLANTE DE .l\1EDULA OSEA

Sesi6n del día 6 de abril de 1970

EFECTOS DE IRRADIACION X EN LOS TEJIDOS HEMATOPOY:eTICOS

NATJ1ANIEL B. KuRNI CK, M. D.

Poco después del descubrimiento de los rayos X y del rádium, se hizo evidente que la energía radiante de muy corta longitud de onda, dentro del intervalo "X" y gamma, tenía importantes efectos biológicos. Sigue en la oscuridad el mecanismo por el cual estos rayos misteriosos, que no producen esencialmente estímulos sensoriales que nos permitan percibir que nos hallarnos sometidos a su acción, causan tales efectos espectaculares y nocivos. Nuestro propósito en esta conferencia es describir algunos de los cambios producidos por la irradiación X en mamíferos, con atención es· pecial a los tejidos hematopoyéticos. Basándonos en algunos de los cambios morfológicos y bioquímicos observados tanto in v·ivo como in vitro, ofre· cemos algtmas especulaciones sobre el mecanismo de acción de la energía radiante.

Se ha sugerido que son más radiosensibles aquellos tejidos cuyas célu· las e>.'Perimentan el intercambio más rápido. Esto viene señalado por la conocida radíosensibilidad de ]a médula ósea, del epitelio gastrointestinal y de algunas neoplasias. Sin embargo, es probable que en los mamíferos sean las células linfoides las más radiosensibles, según determinación de la letalidad. La medición de los cambios en el recuento total de linfocitos circulantes consptuye indudablemente un dosímetro biológico excelente. s; considera que estas células son productoras activas de proteínas, espeCJ· ficamente i.nmunoglobulinus, según viene ¡·eflejado en su rico contenido en cantidad de ribonucleoprotcina citoplásmíca; pero no se caracterizan ~or una breve supervivencia y UJ1 intercambio celular rápido. Al contrario, ex, ste la evidencia de que tales células muestran una larga supervivencia Y una conse1·vación prolongada del ácido desoxirribonucleico de cada una de ellas. Existen dos características de estas células que sugieren por si mismas ser la posible causa de su radiosensibilidad. Una de estas caracterlsticas es su

KURl\ICK. UlRADTACTÓN X HE~IATOPOYÉTICOS 579

contenido particularmente elevado en Ull inhibidor proteínico de la desoxirri­bonucleasa. Más adelante consideraremos el posible papel de esta sustancia en los efectos de la radiación. Otra característica de dichas células es la incapacidad de la mayoría de ellas de metabolizar cortisol, y su suscep­tibilidad a la lisis en presencia del mismo. Cabría especular que el stress debido a la irradiación X moviliza cortisol de la corteza adrenal, con la consiguiente lisis de linfocitos. Sin embargo, como se verá más adelante, produce efectos similares en los tejidos linfoides, pero diferentes en la médula ósea a los debidos a irradiación, y los animales adrenalectomizados no son menos radiosensibles que los animales intactos.

En la aplasia de los ganglios linfáticos y del timo después de la irra­diaci6n X se tiene un reflejo de la sensibilidad especial de las células lin­foides a los rayos X. El timo es un órgano linfoide especialmente adecuado para la investigación.

Eu la primera diapositiva (.fig. 1) se ilustran algunos efectos de la .irradia-

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~:;~ l.- Efeelos de 1~ irradiaci6n de ratones albinos. Hay gran pérdida de peso del Y dtl bazo, pero no del bígado por tratarse de un órgano poco sensible a la irradiacíón.

580 ANALES. SECCIÓN MEDICINA

cwn X en timo y bazo, ambos radiosensibles, comparados co11 el resistente hígado. En esta investigación se sometieron ratones albinos a un total de 780 rad de irradiación X corporal. Como se muestra en la figura, hay una rápida pérdida de masa del timo y del bazo, radiosensibles, pero no del resistente hígado. La disminución ponderal del órgano se debe a pérdida de células, según se demuestra por la pérdida concomitante de DNA. Como es sabido, la cantidad de DNA presente en cada célula es constante e igual (excepto la pequeña fracción de células no diploides). La pérdida de células supera a la disminución en peso del órgano, porque no se reducen el tejido conec­tivo, relativamente acelular, y el líquido extracelular contenido (comprendida la sangre). En el caso del timo se pierden más del 90 % de las células. Para el bazo, la pérdida es de un 90 %; y para el hígado, aproximadamente, del 30%. Hemos medido simultáneamente en estos órganos la modificación de la actividad de la desoxirribonucleasa (DNAsa) iJ1tracelular (figura 2)

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Fw. 2.- Aumento de In cl.esoxirribunucleasa celular por efecto de la irradiación •obre diversas vísceras.

y hemos observado la elevación progresiva que se muestra. ll:s ta alcanza hasta un aumento de 25 veces en las cél]Jlas del timo, de 8 veces en el bazo y menos del doble en el hígado. La médula ósea, radiosensible, ac~~ también una elevación acentuada, aproximadamente 30 veces, de la actiVI­dad DNAsa por célula. La figura 3 muestra la pérdida concomitante

KURNlCK. lRRADlACIÓK X UBMATOPOYÉTICOS 581

de la actividad del inhibidor intracelular de la DNAsa. Como puede obser­varse, esta pérdida supera el 90 % en el bazo. Son estas alteraciones en la actividad de la DNAsa y del inhibidor las que constituyen la base de es­peculaciones sobre el mecanismo de irradiación que consideraremos más adelante.

La especial susceptibilidad de los tejidos linfoides a la destrucción por irradiación X explica indudablemente la pérdida de reactividad inmunológica que experimentan los animales sometidos a irrndiación total del cue1po a dosis supraletales. Como consecuencia, dichos animales son particularmente susceptibles a la infección, incluso por microorganismos que son ordina-

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FtG. J.- Püdida de la actividad inhibidora de la desoxirribonucleasa por efe<:tos de la irradiación.

riamente comensales en el tubo intestinal. Su incompetencia inmunológica les. hace tolerantes no sólo a los microorganismos nocivos sino taro bién a los tepdos extraños. Esto propo1:ciona la oportunidad de injertar tejidos, inclu­yendo las implantaciones salvadoras de médula ósea, que serán la base de nuestras disertaciones sucesivas.

La médula ósea del ratón se vuelve esencialmente acelular, según se demuestra por recuentos celulares. A diferencia de los grandes mamíferos, las cavidades de los huesos largos de los ratones contienen casi un 100% de médula celular. Después de la irradiación X, la médula no está tan repleta

582 ANALES . SECCIÓN l\-rEDlCINA

de células nucleadas, sino, en cambio, de glóbulos rojos circulantes. Así, el ratón irradiado letalmente sucumbe a la infección debido, por una parte, a ser inmunológicamente incompetente, y además, a su carencia de leuco­citos fagocíticos.

Un interesante problema es el de dilucidar si la energía radiante acl{ta sobre la célula misma, incluyendo en este término los componentes químicos de los orgánulos de la célula y de la superficie celular, o bien si la energía radiante actúa produciendo o causando la liberación de productos quími­cos activos que a su vez obran sobre la célula. Ya nos hemos referido a esta posibilidad al señalax la liberación de cortisol como consecuencia de sb·ess. Wruss y otros autores han observado la producción de radicales libres en el agua por los rayos X, y han sugerido que estos radicales 1ibres podrían producir a su vez efectos biológicos. Desde luego, los medios de cultivo bac· teriológico sometidos a irradiación X han mostrado poseer efectos mutágenos sobre las bacterias cultivadas subsiguientemente en ellos. También se han observado efectos a distancia ele una parte del cue1·po después de su irrn· diación X.

Se cree que en efectos observados en tejidos no pertenecientes al campo sometido a irradiación X (efecto abscopal o de alcance) deben intervenir cambios neurohumorales por aumento o disminución de las relaciones neu· rohumorales normales o por causarse la nberación de productos anormales. Hemos investigado tales efectos irradiando solamente partes del ratón )' estudiando los cambios tanto en los tejidos irradiados como en los no sorne· tidos a la radiación.

El experimento ilustrado por la figura 4 revela que la actividad deso­x:irribonucleasa por unídad DNA (en otras palabras, por célula) aumenta en el bazo aun cuando éste haya sido exteriodzado e incluido en una cápsula de plomo durante la irradiación X. Similarmente, aunque los efectos son menos marcados que cuando se comprende el bazo en el carppo de irradiación, eJ peso de este órgano y la celularidad disminuyen después de la inadiación X del cuerpo con el bazo exteriorizado y protegido. En la diapositiva que se presenta (no publicada), la comparación entre las se· ries 1 y 2 demuestra que la cimgía tiene por sí sola muy pequeños efectos

1

sobre el número de células y la actividad DNAsa. T.a Sf'rie siguiente muestra el efecto de 800 r enviados solamente al bazo exteriorizado, con el cuerpo protegido de la irradiación. Observamos sólo una disminución ligera en el número de células y un llgero aumento en DNAsa celular. En contraste, si la misma dosi.~ de 800 r se envfa al cuerpo pero no al bazo, éste sufre una pérdida muy notable en celularidad (según deteiminación del DNA tot~l) y un aumento muy considerable de la actividad DNAsa por célula promediO. Aun con la administración aislada al bazo de 4.000 rad no se produce Wl

efecto tan grande de pérdida en células (DNA total) y de incremento de la actividad DNAsa por célula como el logrado con la administración 31 cuerpo de 800 r con el bazo resguardado de la irradiación directa. El efecto

KURN!CK. Ul!IAD!ACIÓN X H.E~iATOPOYÉTICOS 583

F1c. 4. - Efecto de la ;,., .... diación corporal sobre el bazo1 con y sin proteccci6u

de este 6rgaJ1o.

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EFFECT Of TOTAL BODY X· IRRAOIATION ON THE SPLEEN IlTH AID IITHOUT SPlEEll SHIELDING

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máximo se obtiene con 800 r administrados a todo el cuerpo, bazo inclusive. El examen histológico revela que siempre el cambio más importante que ocurre en el bazo es la reducción del número de linfocitos en la periferia de los folículos. Los resultados sugieren dos hipótesis importantes. Una es que los efectos de insulto de la irradiación X no tienen directamente como diana la célula, sino que son más bien el resultado de productos que actú¡m secundariamente ~obre la célula, y que la concentración de dichos productos es función a la vez de la dosis y de la masa total de tejido irradiada. Según esta hipótesis, podríamos explicar la observación de que la irradiación di­recta del pequeño volwn.en de bazo tiene un efecto mucho menor que la irradiación de lodo el cuerpo sin irradiar el bazo. Este mecanismo incluiría la posibilidad de un efecto endocrino. La otra hipótesis es que las células del bazo se hallan en constante intercambio con la reserva corporal. El efecto de irradiar sólo el bazo sería, pues, el de la irradiación solamente de lllla fracción muy pequeña de toda la reserva, resultando de ello cambios poco importantes. Por otro lado, la irradiación de la mayor parte del cuer­po (200 veces el bazo solo) daría por resultado un trastorno importante de la reserva y se reflejaría en el bazo en virtud del intercambio de éste con el resto del reservorio. Para investigar si la dosis desempeñaba un papel, noso­tros irradiamos las exh·emidades posteriores de ratones con dosis de 800 a 4.000 r, todas Sllprnletnles si se adminish·an a todo el cuerpo. Al aumentar la

584 ANALES. SECCIÓN MEDICINA

dosis se observa, desde luego, una reducción creciente en la población celular del bazo y en la actividad DNAsa por célula. A fin de comprobar si ciertos puntos específicos del cue1po tenían efectos de alcance o abscopales peculia­res, o si el efecto dependía del volumen de Lejido irradiado, nosotros irradia­mos diversas partes del cuerpo con 800 r. Dado que el timo es mucho más sensitivo que el bazo, presentarnos aquí (figura no publicada) los datos corres­pondientes al timo. En las cinco primeras columnas del grabado no está in­

cluido el timo en el campo sometido a irradiación X. El efecto sobre el timo parece aumentar con el volumen de tejido irradiado. La sexta columM refleja el efecto sobre el timo cuando la irradiación se dirige sólo al mismo. El efecto aumentado demuestra que las células del timo son directamente radiosensibles, y prueba que los efectos de la radiación no son exclusi­vamente o, por lo menos para el timo, incluso plimariamente del tipo de alcance o abscopales. El incremento del efecto con la irradiación de tm

volumen corporal creciente, según se muestra en las cinco {¡]timas columnas, indica, sin embargo, que los efeclos de alcance desempeñan probablemente un papel. La figura 5 1·esume esta evidencia. La primera columna ilustra

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lumna ilustra sobre los efet· too abscopa les (de alea neo), la segunda de los efecl<>s di rectos, y In tercer." de ambos efectos por irrad.ac•óo

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XUR!\.fJCK. IRRADIACJÓ:\ X }IEMATOPOYÉTICOS 585

sobre los efectos de alcance o abscopales, sobre los efectos directos la segunda, y la tercera sobre los directos y de alcance o abscopales combi­nados.

La diapositiva (no publicada) ilust ra un estudio similar respecto a la mé­dula ósea. En este experimento, las patas posteriores son irradiadas con diver­sas dosis estando protegido el resto del cuerpo. Nuevamente se obsexvan efectos tanto directos como indirectos. Después ele la irradiación corporal de 800 r, con una pata protegida, ocUlTe la recuperación de la médula irradiada. Esto se debe a la repoblación de la médula ósea irradiada a partir de la pata protegida. Si el animal no muere por efectos no-hematopoyéticos, como es el caso después de 800 r con una pata protegida, ocurre la repoblación desde dicha extremidad. Estos resultados sugieren que se produce un im­portante efecto de irradiación X en médula ósea protegida a consecue11cia de intercambio con la reserva medular irradiada. Como Tesultado, el bazo y la médula ósea, que intercambian células rápidamente, muestran mayores efectos de alcance o abscopales que el timo, que intercambia muy poco.

En la figtu·a 6 se ilustra el hecho de que el intercambio de la re-

THtiiTI'· I lAl' HI!KVIVAL: T OTAl. BUI>l' lKKAIJIATIOS, ÜN& LE<; Pl!OTECTED, PK<>TEI.'TEU LEO lltKA DIATED Sl'RKI:(II:ENTLY

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• Aeauming that all celia migra te equally and uaing the iaologoua C3H data ae equinlent lo autologous, from Table VIL

b Confld~nce limite (or p = 0.1 in parentheeea.

Ptc. 6.- Supervivencia de animales cuando se irrndi" por separado una pierna y el resto del cuerpo, y q ue demuestra los efectos protectores de la médula ósea no irradiada.

serva hematopoyética desempeña un papel importante en los efectos por nosotros observados y en la supervivencia que ocurren cuando se admi-

586 ANAl. ES. SECCIÓN MEDICINA

nistran al cuerpo 800 r con una pata protegida. En estos experimentos se irradió a ratones, con una pata protegida, 800 r. Al cabo de un intervalo de tiempo se irradió la pata protegida, resguardando en cambio el resto del cuerpo. Obsérvese que si la pata protegicJa no se irradia subsiguientemente, todos los animales sobreviven. Si la pata protegida se irradia inmediata­mente después o 30 minutos después del resto del cuerpo, todos los ani­males mueren. Al aumentar hasta tma hora y luego a dos horas el intervalo entre la irradiación del cuerpo y la de la pata protegida, la supervivencia mejora progresivamente. Basándonos en experimentos sobre el número de células isólogas inyectadas que se requieren para proteger a un ratón contra la leta]idad por irradiación total del cuerpo, hemos podido estimar el número de células que habían emigrado desde la médula protegida al torren­te circulatorio dmante el espacio de tiempo anterior a la irradiación de la pata antes protegida. En la última columiJa se ha invertido el experimento. Aquí se irradió primero la pata con 800 r y luego, a intervalos, el resto del cuerpo. En este caso, la pata irradiada debe acumuJar primero, del resto del cuerpo, suficientes células de médula ósea viables para, a su vez, repoblar el resto de la médula ósea cuando se destruye ésta por la irra­diación subsiguiente. Esto no se consigue en el término de 2 horas, según puede verse en el cuadro, pero se logra completamente en 48 horas. Los dos experimentos permiten calcular que I / 60 aproximadamente de las célu­las emigran de un lugar de la médula cada hora y que, esencialmente. ocurre el reemplazamiento completo en 48 horas. La emigración desde el bazo parece ser aún más rápida. En otro experimento, el ratón es irradiado con 1.000 r mientras el bazo exteJiorizado se halla incluido en una cápsula de plomo. En seguida, a intervalos, se escinde el bazo encapsulado. Observa­mos que en 15 minutos no existian suficientes células procedentes del bazo encapsulado para la repoblación del sistema hematopoyético, pero a los 30 minutos se produce una supervivencia notable, y a los 60 minutos quedaba asegurada la supervivencia.

Nosotros hemos ideado un tipo de computador de la lesión de la mé­dula ósea por radiación y de la repoblación a partir de los sitios prote­gidos. Se trata de un sistema bastante complicado, pero que nos ha ser.,.ido mucho para nuestros estudios.

Es indudable que la irradiación X puede causar directamente injuria a los componentes bioquimicos de 'las células. Sin embargo, nuestras inves­tigaciones sobre la reacción de sensibilidad de los enzimas, particularmente la clesoxirribonucleasa, a la irradiación X muestran que las soluciones acuosas del enzima pierden su actividad sólo después de muy altas dosis 1de irra­diación X, bastante superiores a las que producen efectos biol6gicos muy marcados. Son necesarias dosis de 10.000 r o superiores para que se obser­ven efectos apreciables. Las nucleoproteínas sufren también injwia por la irradiación X in vitro, pero s6lo si las dosis son elevadas. Investigacione.c; realizadas con nuestro colega Dr. BAUER han señalado que después de la

KURt.'lCK. ffiRAOIACJÓlS X JTEMATOPOYÉTICOS 587

irradiaci611 in v·ivo a dosis biológicamente efectivas, el enlace entre el ácido clesoxinibonucleico y la proteína de los órganos radiosensibles se afecta secundariamente a la despolimerizacíón parcial del DNA. El hecho de que no ocurra esto en órganos racliorresistentes indica que la energía de los rayos X no actúa diroctamenle sobre el ácido nucleico, sino más bien que la despolimerización es secundaria a la acción enzimática, sobre la cual volveremos a tratar l1acia el término de esta conferencia.

Las diferentes especies muestran variación en las respuestas de la médula 6sea a la in-adiación local. En el ratón, la irradiación local, por ejemplo, de una extremidad, incluso a dosis tan elevadas como 10.000 r, se sigue de la recuperación completa, presumiblemente por repoblación a partir de sitios no irradiados. Esto es cierto no sólo si la irradiación se practica de una. vez, como en los experimentos que acabamos de considerar, sino también cuando la irradiación se efectúa a dosis divididas, como suele practicarse en radioterapia humana, en cuyo caso ocurre la recuperación incluso si se ha expuesto una pata hasta a diez txatamientos diarios de 1.000 x cada uno. Por otra parte, la radiación intensiva de un solo sitio en el hombre da por resultado aplasia de médula ósea, con sustitución de ésta por grasa. Sub­siguientemente, si los efectos no son permanentes, la recuperación de la médula ósea irradiada parece ser resultado de la multiplicación del remanente de células supervivientes, produciendo nódulos de médula ósea de recupera­ción. Nosotros sugerimos que esta diferencia entre el ratón y el hombre no se debe a diferencias del estroma o del lecho vascular de las dos especies. Lt base de esta conclusión es que, como se verá en tma siguiente conferencia, cuando se inyecta médula ósea en la red vascular del hombre, previamente aplástico, la médula grasa experimenta xepoblación, igual a como ocurre en el ratón. Por lo tanto, sugerimos que la diferencia reside en el hecho de que el intercambio celular entre los puntos medulares es muy escaso, si llega a ocurrir, mientras que en el ratón se produce en alto grado, según acabamos de e>.-poner. En la rata, la situación parece diferir de la del hombre y del ratón. CROSBY ha señalado que la irradiación extensa y repetida de la médula ósea de la rata origina fibrosis. En consecuencia. la médula no es grasa, como en el hombre, ni se repuebla, como e.n el ratón.

Otra cuestión interesante que concierne a todos los biólogos es la de saber si existe una dosis umbral por debajo de la cual la radiación no produce trastornos, o bien si existe un continuo de injuria entre la dosis cero y la dosis letal. Para estudiar este problema hemos administrado diversas dosis de irradiación X a todo el cuerpo y hemos determinado los cambios pro­ducidos en el bazo, observando que hasta que se alcanza la dosis letal de 800 r existe una elevación progresiva de la actividad DNAsa por célula promedio, y disminución del número total de células en el bazo. Una vez a~~~da la dosis letal de 800 r el cambio es pequeño o nulo. En la irra­diaclQn a dosis pequeña, existe un aumento constante en los efectos, que se hallan extrapolados hasta la dosis cero de rayos X. Aun a 25 r se observan

A:-IAI. F.$. SECCIÓX ~!EDTC~Á

efectos muy notables. Este resultado sugiere que los efectos biológicos de los rayos X no tienen umbrnl y que todas las dosis poseen algún efecto.

Consideramos ya oportuno presentar, a partir de Lodo lo que hemos expuesto, una hipótesis sobre el mecanismo de los efectos de radiación biológicos. Ya hemos señalado que los efectos observados son resultado de una combinación de intercambio entre células hematopoyéticas lesionadas e indemnes, y también probablemente de efectos tóxicos causados por pro­ductos de irradiación aun cuando las células no estén en el mismo campo irradiado. Ahora bien, sobre la forma cómo la irradiación lesiona células nos hemos limitado a exponer que no era probablemente por efecto directo sobre enzimas o nucleoproteínas. Existe el hecho interesante de que dosis de rayos X, colchicina, mostaza nitrogenada y cortisona que producen morta­lidad similar (30% en 30 días), causan depleción similar del número de células e incrementos también similares de la actividad DNAsa en órganos radiosensitivos (pero se exceptúa la ausencia de efecto de la cortisona sobre la médula ósea). Se sugiere una ruta común.

Nosotros sugerimos que los rayos X pueden romper el equilibrio entre el inhibidor de la desoxirribonucleasa y este enzima, ambos presentes en el citoplasma celular. El resultado sería la activación de desoxirribonucleasa, como hemos observado repetidamente en esta disertación. Sugerirnos que el enzima, a su vez, ataca el Di':A nuclear y origina la muerte consiguiente de la célula. Esto podría explicar el hecho de que los efectos de la irradiación son más tardíos que inmediatos, y que la nucleoproteína de las células radio­sensibles responde diferentemente que la de las células resistentes. Pueden excluirse por completo oh·as posibles sugerencias sobre los mecanismos del aumento de la actividad DNAsa, excepto la de la producción incrementada. Con nuestro método analítico se rompen las mitoconclria~, y ligeros aumentos absolutos en la actividad DNAsa total excluyen las otras explicaciones posi­bles, ya que aquéllas proporcionan un aumento en la concentración de enzima pero no en la actividad total. También es interesante señalar que con el envejecimiento decae progresivamente en la mayoría de los órganos la actividad del inhibidor de la desoxirribonucleasa. Concomitantemente, con el envejecimiento aumenta la actividad desoxirribonucleasa. Los estragos causados por el tiempo en sí solo, afortunadamente a escala muy inferior, pueden tener cursos comunes con los originados por la energía radiante.