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Fitoquímica y ensayos Farmacológicos in vitro de Lippia citriodora

Astudillo Machuca Adelina, 1López Cisneros Carmen Lucía2

1Universidad de Cuenca, Laboratorio de Farmacognosia. 2Universidad de Cuenca, Laboratorio de Microbiología.

1adelina52_2@hotmail.com 2carlulopez@yahoo.com,

RESUMEN Se realizó la investigación bibliográfica sobre el uso y las acciones farmacológicas de Lippia citriodora utilizada con frecuencia en infusón por la medicina tradicional y por la población debido a su agradable aroma y sabor. No se encontró su uso como antifúngica ni como antibacteriana. Se procedió a trabajar el tamizaje fitoquímico y se evaluó la actividad antimicrobiana (bactericida)y antifúngica (fungicida) con el extracto etanólico y las fracciones clorofórmicas y acuosas. Se demostró que el extracto etanólico, la fracción acuosa, las fracciones clorofórmicas B y C, y la fracción acuosa residual E manifestaron actividad antimicrobiana frente a Stafilococo aureus. Esta última fracción indicó actividad también para Escherichia coli. La fracción clorofórmica C señaló actividad para Cándida krusei y la fracción clorofórmica B, la acuosa E y la etanólica fueron inhibidoras para Cándida albicans. El screening fitoquímico determinó la presencia de: Taninos, Triterpenos y esteroides, compuestos fenólicos, Aminoácidos, Resinas, Glúcidos, flavonoides, quinonas y alcaloides. Finalmente se relacionó la actividad farmacológica con los metabolitos encontrados. Este trabajo contribuye al conocimiento de nuestra flora y amplía la posibilidad de utilización de esta especie. Palabras clave: Lippia citriodora, fitoquímica, actividad antimicrobiana y antifungal. INTRODUCCIÓN Las plantas han evolucionado desde hace millones de años y como consecuencia de ello las más evolucionadas son poseedoras de una maquinaria enzimática potente que les permite utilizar novedosas rutas metabólicas para la biosíntesis de metabolitos secundarios que les facilite adaptarse mejor a las condiciones adversas y competitivas del medio ambiente. Estas plantas por lo tanto están en mejores condiciones de producir fitocompuestos para interactuar de manera más eficiente y agresiva contra los depredadores. El Ecuador es un país rico en plantas medicinales, la medicina tradicional utilizada desde la antigüedad ha ido acumulando conocimientos prácticos, de generación en generación, por medios orales y escritos, constituyendo hoy en día el uso de plantas medicinales una gran alternativa para preservar y recuperar la salud sobre todo en comunidades que están geográfica o culturalmente aisladas. Esta práctica médica ha sido reconocida por la OMS y se han desarrollado programas para que sea incorporada a la atención primaria de salud. Por otra parte los ingentes recursos naturales existentes requieren ser estudiados, y en especial las especies nativas de América y del Ecuador en particular, ya que son muy apreciadas por la población debido a sus propiedades terapéuticas. (Soejarto 1995, Veerporter1998) Se han hecho miles de estudios de actividades antibacteriana y antifungal, pero aun así no son suficientes, frente a la necesidad urgente de combatir enfermedades infecciosas cuyos agentes etiológicos han creado resistencia a los antibióticos existentes. En la presente investigación, se ha estudiado una especie de la familia Verbenaceae, Lippia citriodora, (Aloysia triphylla), cuyo nombre común es Cedrón. El Cedrón es una planta arbustiva que puede medir entre 1,50 y 2,50 metros de altura. Sus tallos son largos, leñosos, redondos o angulosos, ramificados en la parte superior, provistos de finas rayas lineares. Las hojas son simples, rugosas, reunidas en verticilos de tres, raro cuatro, su limbo, entero o un poco dentado, de color verde pálido, presenta una

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nervadura mediana, saliente en la cara inferior, de la cual se destaca una serie de nervaduras secundarias paralelas, que se reúnen para formar una especie de cordón paralelo al borde foliar, y despiden, al ser restregadas, un agradable olor a limón, lo mismo que las flores; éstas son pequeñas, con la corola ensanchada superiormente y bilabiada, blancas por fuera y azul violáceo por dentro, y se ubican al extremo de los tallos en espigas agrupadas en panojas. El fruto es una drupa que encierra dos granos que a veces no llegan a la madurez. Las hojas al frotarlas entre los dedos desprenden un delicado y riquísimo olor a limón y por eso se ha usado en perfumería, cosmética e incluso en pastelería. Su floración tiene lugar en verano. Luís Cordero describe a esta planta como originaria de Uruguay, Argentina y Chile, en algunas partes se la puede encontrar silvestre. Se la cultiva en numerosas partes del mundo en América desde Estados Unidos hasta Argentina, Europa (sur), África norte y sur. (Berdoncés s/a, White 1985). La parte utilizada son las hojas y sumidades floridas. Es una droga Oficial, monografiada desde la 5a. edición de la Farmacopea Nacional Argentina. Como antecedente se hizo una investigación bibliográfica para conocer las virtudes medicinales, usos y algunos compuestos químicos que se indican a continuación. Las obras consultadas se exponen en orden cronológico para apreciar que conforme se han ido desarrollando las técnicas de análisis, van asomando datos sobre los compuestos químicos presentes en Limppia citriodora.

AUTOR USOS

COMPUESTOS

CORDERO Luís. Estudios Botánicos. Publicaciones del Departamento de Difusión Cultural. Cuenca. 1984

Estomacal, carminativa, antiespasmódica

WHITE Alan. Hierbas del Ecuador. Ediciones Libri Mundi. Quito. 1985.

Febrífugo y sedante, estomáquico y antiespasmódico, indigestión y flatulencia.

KOSEL Carlos. Guía de la Medicina Natural.: Editorial De la Misión La Verdad Presente. Colombia. 1988.

Digestión, enfermedades de los nervios, arterioesclerosis, mordeduras de animales, histerismo, abatimiento….

QUEZADA Alberto, et al. . La Práctica médica Tradicional. IDICSA, segunda edición. Cuenca. 1992

Carminativa Aceites esenciales

Pérez Arbeláez Enrique. Plantas Útiles de Colombia. . Quinta Edición. Fondo FEN Colombia.1996

Tónico pectoral y calmante, antiespasmódico y sudorífico suave, antilegañoso. Lippis significa legañas

BERDONCES i Serra Josep Lluís. Gran Enciclopedia de las Plantas Medicinales. Ediciones Tykal. s/a Madrid (2001, fecha de adquisición)

Eupeptica, estomacal, febrífuga, expectorante, espasmolítica Sistema respiratorio bronquitis y tos espasmódica, sedante y expectorante, indigestión y debilidad estomacal. Las hojas para cataplasmas del dolor de muela

Aceite esencial(0,1-0,2%): contiene más de 120 principios diferentes, entre los que destaca el citral(35%), limoneno, linalol y terpineol, cíneol, cariofileno

Varios autores. Plantas que Propiedades estomacales,

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Curan. Remedios Milenarios y otras terapias alternativas. Cultural Librera Americana S. A. Argentina. 2003

estimulantes y antiespasmódicas. Digestiones lentas y difíciles, inapetencia. Nerviosismo y decaimiento.

AGAPITO Teodoro, Sung Isabel. Fitomedicina. 1.100 Plantas Medicinales. Tomo I. Editorial Isabel I.R.L. Perú. 2005

Estimulante del apetito, mejora las digestiones lentas, el mal aliento y la flatulencia. Para tratar el stress. Carminativo, antiespasmódico. Febrífuga, hipotensivo, problemas respiratorios. Antirreumático, El extracto alcohólico es acaricida y bactericida contra Escherichia coli, Micobacterium y Estafilococo aureus.

Aceite esencial contiene: Cíneol, citral(20-39%), sesquiterpenos(40-45%), linalol (4-11%), geranial. Las hojas contienen: ácidos fenólicos, flovonoides, taninos, flavonas y alcaloides.

Por lo general los pobladores la usan en forma de infusión, de la planta entera o solo las hojas, o a veces combinadas con otras plantas, como en el agua de frescos conocida también como horchata, y raramente en forma de cataplasmas para calmar el dolor de muela. Se puede observar que no es común la utilización como antibacteriana y no se reporta como antifúngica. MATERIAL Y MÉTODOS Material Vegetal Tratamiento de la droga: se realizó la recolección de las ramas el día 2 de Marzo del 2007 una zona urbana de la ciudad de Cuenca. Luego se procedió a la selección y clasificación. Se separaron las hojas más verdes eliminando la mayoría de impurezas tales como: ramas y hojas secas, tierra, polvo, insectos, etc. Para el secado se colocaron las hojas entre papel periódico, se selló y se colocó en un túnel de secado con control de circulación de aire forzado y temperatura de 40ºC durante una noche. La droga seca, triturada (polvo fino) y tamizada se guardó en frascos de vidrio cubierto con papel de aluminio protegido de la luz y etiquetado. Se lo conservó bien cerrado con el fin de evitar el contacto con polvo, insectos, humedad y para de esta forma preservar los principios activos. Durante todo este proceso se siguieron las técnicas dictadas por la Farmacopea Europea citadas en Trease, 1991 y Kuklinski, 2000. Luego se realizó el control de calidad de la droga con las siguientes determinaciones: Caracterización macroscópica, microscópica y organoléptica. Determinación de materia orgánica e inorgánica, determinación de partes de la propia planta, contenido de humedad (10%). Pruebas histoquímicas y determinación de aceites esenciales. Se realizó el control microbiológico para garantizar que la materia prima se encuentre en óptimas condiciones (Dehesa 1996). En todas las determinaciones se consiguieron valores dentro de los estándares permitidos por la farmacopea española. Luego el tamizaje fitoquímico y el fraccionamiento se desarrollaron empleando reacciones de coloración y técnicas de cromatografía de capa fina, indicadas por Martínez (2004), a fin de identificar los grupos químicos responsables de la actividad antimicrobiana. Preparación de los Extractos

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Se pesaron 50g de la droga seca y pulverizada, se añadió etanol en una proporción de 1:3(P/V), se dejó en maceración con agitación en un shaeker a 210rpm por 24 horas según la técnica indicada por el CYTED 1995. A partir de este extracto se procedió al fraccionamiento siguiendo la guía del tamizaje fitoquímico de Martínez, obteniéndose las siguientes fracciones: etanólico(EE), el extracto acuoso(FA), extracto clorofórmico proveniente de la acidificación (FB), extracto clorofórmico procedente del fraccionamiento básico(FC), extracto clorofórmico(FE) y el extracto acuoso restante (FE). Cada fracción se llevó a sequedad en un rotavapor. Para utilizar se pesó el extracto seco y se resuspendió en dimetil sulfóxido (DMSO), a una concentración de 50mg/ml. La concentración de los productos vegetales que se inocularon en el pocillo, fue de 2.5mg y el volumen de 50 µl. Screening Antimicrobiano Microorganismos La actividad antibacteriana y antifungal se probó contra tres cepas de bacterias Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 y 2 cepas de levaduras, Candida albicans CECT 3153A y Candida krusei CECT 10688. Preparación del inóculo Las bacterias fueron cultivadas en caldo de Triptosa soja (MERCK CodVM276159) a 35±1ºC con agitación constante, se estandarizó el cultivo en medio líquido utilizando un Standard McFarland # 05 de DO625 entre a 0.8-1, equivalente a 1x108 células/ml. Luego se inocularon con aplicador de algodón estéril en la superficie de una placa de petri con agar de Muller Hinton (MERCK, cod VL379337) (NCCLS 2006, Prescott, 2004). Las levaduras se cultivaron en medio líquido YPD (Yeast peptona dextrosa), preparado en el laboratorio, a 25±1ºC con agitación constante, se estandarizó el cultivo en fase exponencial de crecimiento y luego se cultivaron uniformemente en medio sólido de YPD (Astudillo, López, 2002,2003, J. M. Becker 1996). Controles Como controles positivos se utilizaron para S. aureus Penicilina 10UI (Sandoz Lote 141914), para E. coli Amikacina 30mg/ml (Lab. Bristol Lote 07C119), para Ps. aeruginosa Ceftriaxona 30mg/ml (Lab. Vitalis Lote C060711), para C. albicans y C. krusei, Nistatina (Bristol-Meyers-Squibb). Estos antibacterianos se los seleccionó consultando la edición del 2006 de la Performans Standard NCCLS. Se trabajaron también controles negativos de DMSO y agua destilada estéril. Método de la difusión en agar variante de pocillo Se procedió a cortar el agar mediante un sacabocados estéril formando pocillos de 7mm de diámetro separados entre sí por 20mm, en cada uno de ellos se colocó 50 µl de los productos a ensayar. Las placas de petri fueron incubadas a las temperaturas adecuadas para cada microorganismo por 24 a 48 horas en condiciones aeróbicas. Después de la incubación se observó un crecimiento microbiano confluente y se pudo determinar claramente los halos de inhibición (ausencia de crecimiento) alrededor del pocillo, que se pudo medir en milímetros. (Valgas, 2007) Evaluación de la actividad Para determinar cuantitativamente la actividad antibacteriana y antifúngica de los productos ensayados, se utilizó el cálculo del Porcentaje de Inhibición Relativa (PIR) respecto a la inhibición de los controles positivos. Los diámetros se midieron en milímetros, desde tres puntos diferentes, ya que no siempre el halo es una circunferencia perfecta, el resultado se expresó como la media de estas tres mediciones.

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Asumiendo que el máximo efecto inhibitorio es el producido por el control positivo (CP) se determinó el porcentaje del efecto de inhibición del crecimiento del microorganismo de cada extracto, relativo al CP y se calculó con la siguiente fórmula: Diámetro halo inhibición del extracto PIR = -------------------------------------------------------- x 100 Diámetro halo inhibición del control

El criterio que se siguió para seleccionar las plantas con actividad positiva fue el valor del PIR igual o mayor al 25% (CYTED, 1995) respecto al control químico (Rivero, 1997). RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el tamizaje fitoquímico se encontraron los siguientes compuestos: aminoácidos, compuestos fenólicos, flavonoides, triterpenos y esteroides, quinonas, taninos y alcaloides. En el extracto acuoso se encontraron también resinas y glúcidos. En el fraccionamiento se encontraron los siguientes metabolitos: Fracción acuosa A (FA): aminoácidos, compuestos fenólicos y flavonoides, taninos Fracción clorofórmica ácida B (FB): triterpenos y esteroides Fracción clorofórmica alcalina C (FC): triterpenos y esteroides Fracción clorofórmica D (FD): no se encontró ningún metabolito Fracción acuosa residual E (FE): Taninos, compuestos fenólicos Fracción etanólica EE (FEE): quinonas, taninos condensados y alcaloides Se pudo determinar y fundamentar de forma científica el uso en la práctica medica popular de Lippia citriodora al relacionar la acción farmacológica, reportada en la investigación bibliografica, con los metabolitos encontrados en el tamizaje fitoquímico. Tabla 1.

Tabla 1. Relación de la acción farmacológica y los metabolitos

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ACCION FARMACOLOGICA METABOLITO

Aperitivo Compuestos fenólicos, alcaloides

Digestivo, eupéctico Taninos

Tónico Taninos

Carminativo, flatulencia Taninos

Tónico pectoral Resinas

Sedante Alcaloides

Antilegañoso Flavonoides

Antiespasmódico Flavonoides Los datos que se exponen en la tabla anterior se investigaron en Kuklinski 2000 y Brunetton 2001. Analizando los resultados se concluye que el uso es acertado para las acciones farmacológicas indicadas en la tabla 1, pero no se encuentra relación para acción hipotensiva, para la arterioesclerosis, mordedura de animales, febrífugo y sudorífico indicadas en algunos libros de la consulta. También se concluye que se la subutiliza ya que contiene principios activos de carácter antibacteriano y antifúngico que se desconocen en la practica médica tradicional y popular. Los resultados de la actividad antibacteriana encontrados en este estudio se indican en la tabla 2.

Tabla 2 .Resultados del ensayo antibacteriano: Sa Ec Ps Ca Ck Extracto Ф en mm

Ф en mm

Ф en mm

Ф en mm

Ф en mm

FA 17 0 0 0 0 FB 20 0 0 11 0 FC 28 0 0 0 12 FD 0 0 0 0 0 FE 0 0 0 11 0 EE 11 15 0 11 0 Sa: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Ca: Candida albicans CECT 3153A Ec: Escherichia coli ATCC 25922 Kc: Candida krusei CECT 10688 Ps: Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 Ф: Diámetro de inhibición en mm

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Analizando el resultado del efecto de cada fracción de concluye que:

Ninguna de las fracciones resultó ser efectiva para Pseudomona aeruginosa ATCC 27853. La fracción D no dio sensibilidad para ninguno de los microorganismos. De las fracciones positivas se observa que: La fracción EE da respuesta inhibitoria evidente para tres microorganismos, S. aureus, E. coli, C. albicans. Las fracciones FB y FC evidencian positividad para dos microorganismos y las fracciones FA y FE inhiben el crecimiento de un microorganismo.

El ensayo se trabajó simultáneamente con los controles positivos químicos.

Tabla 3. Diámetro de inhibición de los controles en milímetros. POCILLO

MICROORGANISMO CONTROL 50µl

S. aureus Penicilina 10U 21E. coli Amikacina 30µg/ml 17Ps. Aeruginosa Cefalexina 30µg/ml 14C. albicans Nistatina 500000U/ml 30C. krusei Nistatina 500000U/ml 22

Los resultados del PIR de los extractos calculados de acuerdo a la ecuación indicada anteriormente nos dan los resultados de la tabla 4 Tabla 4. Porcentaje de inhibición relativa respecto a los controles correspondientes. Fracción Sa Ec Ca Ck FA 80 % 0 % 0 % 0 % FB 95 % 0 % 36 % 0 % FC 133 % 0 % 0 % 54 % FE 0 % 0 % 36 % 0 % EE 52 % 88 % 36 % 0 % Sa: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Ca: Candida albicans CECT 3153A Ec: Escherichia coli ATCC 25922 Ck: Candida krusei CECT 10688 Según el criterio de selección para considerar como positivas las reacciones de inhibición del crecimiento microbiano y observando los datos, se puede evaluar y definir que la mayor sensibilidad se obtuvo para Staphylococcus aureus en la fracción C (FC) con un porcentaje de 133% y el menor valor se obtuvo para Candida albicans con el 36%. Los demás extractos con diferentes porcentajes de inhibición intermedia entre estos dos valores nos dan un total de 9 ensayos positivos, es decir el 45% del total de los extractos estudiados. Se puede observar también que cuatro de las cinco fracciones inhiben a Staphylococcus aureus, le sigue Candida albicans, con tres extractos, aunque con porcentajes que se considerarían como valores bajos y Escherichia coli y Candida krusei con un extracto positivo cada uno. La acción farmacológica bactericida y fungicida relacionada con los metabolitos encontrados en cada fracción en Kuklinski, 2000 y Brunetton, 2001. La actividad positiva para Staphylococcus aureus, del extracto FA se debe a la presencia de los compuestos fenólicos y taninos; de los extractos FB y FC a la presencia de los Triterpenos y de la fracción FEE se debe a los compuestos fenólicos, a los taninos y a las quinonas que se reportan con esta acción farmacológica (fig 1). A los mismos compuestos en esta fracción se debe la actividad antibacteriana para Escherichia coli(fig.2). La actividad fungicida para Candida albicans, en la Fracción FB se debe a los compuestos terpenoides y en la fracción FEE (fig.3), a los compuestos fenólicos, taninos, quinonas y a los flavonoides presentes en esos extractos. En el caso de la

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fracción FE, con un moderado contenido de taninos se observa que el efecto no es fungicida sino fungistático como se puede ver en la fig. 4 La actividad fungicida para Candida krusei, en la fracción FC se debe a la presencia de triterpenos del tipo saponósido que se encuentran en esta fracción. Fig. 5

Figura 1 E. aureus Figura 2 E. coli EE Figura 3 C. albicans FB

Figura 4 C. albicans con FE Figura 5 C. krusei con FC Con este estudio se contribuye a revalorizar el uso de Lippia citriodora, con su aplicación probada como antibacteriano y antifúngico, propiedades que se suman a las anteriormente citadas. Así se hace énfasis en el aporte importante de la investigación de las plantas medicinales para superar las dificultades de salud básica en nuestro país al utilizar con fines terapéuticos los extractos acuosos y alcohólicos de la planta estudiada. Bibliografía

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