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5/19/2018 10 purificacion parcial fosfatasa[].docx

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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA

MOLINA

CURSO:

Enzimologa.

TEMA:

Prctica N 10 Purificacin parcial de fosfatasa cida-

PROFESOR:

Aliaga Rota, Pilar.

GRUPO:

B*

10 de diciembre, 2012


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I. FUNDAMENTO

La purificacin parcial de fosfatasa cida de hgado realizada en la prctica se fundamenta

en la precipitacin fraccionada con sulfato de amonio. La concentracin salina suele

expresarse como fuerza inica, entonces esta tcnica logra la precipitacin de protenas

mediante el aumento de la fuerza inica del medio, y es que, en general, las protenas

aumentan su solubilidad a concentraciones salinas bajas (salting in) y precipitan a

concentraciones salinas altas (salting out) (Primo, 1995).

Esto se produce porque las grandes

cantidades de sal en la solucin

disminuyen las interacciones

protena-agua ya que quitan la

capa de solvatacin, generando que

predominen las interacciones

protena-protena lo que provoca la

precipitacin de las mismas

(Universidad Nacional de Quilmes,

2010). Como la concentracin de

sales a la que precipita cada protena

es distinta, entonces una mezcla de

protenas puede purificarse

fraccionadamente por la adicin

creciente de sulfato de amonio,

separando despus de cada adicin el precipitado con las protenas restantes, aislando en

cada fraccin una fraccin ms pura de la enzima de inters.

II. REVISIN LITERARIA.

Las enzimas son protenas. Las protenas se purifican por procedimientos de

fraccionamiento, en una serie de pasos independientes en el que se aprovechan las

propiedades fisicoqumicas de la protena de inters para separarla de manera progresiva

de otras sustancias (Voet & Voet, 2006). Para ello es necesaria la liberacin de entre las

estructuras en las que se encuentra la enzima de inters y mantenerla en solucin. Esto seconoce como solubilizacin y extraccin de protenas. Muchas necesitan de una ruptura

mecnica para que la clula libere su contenido, para el presente ensayo se utiliza la tcnica

de homogenizacin para tal fin. Una vez liberada, la enzima queda expuesta a agentes que

la pueden daar de forma irreversible por lo cual es importante mantenerla estable, por

ello suele disolverse en soluciones amortiguadoras (buffers) eficaces en el rango de pH en

el que el material es estable (Voet & Voet, 2006).

De acuerdo a Saeed (2009) la fosfatasa cida de alto peso molecular de hgado de pollo

tiene un pH ptimo entre 4.5-5.5 y una temperatura ptima a 50C.

Ilustracin 1. Dependencia de la solubilidad con laconcentracin salina. Imagen disponible en:

http://elcuadernodecalpurniatate.blogspot.com/2012/09

/sales-proteinas-y-solubilidad-efectos.html


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Para la separacin fraccionada de la enzima de inters pueden utilizarse tcnicas que

aprovechen las propiedades de solubilidad, termoestabilidad, polaridad, tamao,

especificidad de la unin, etc. (Voet et al, 2007). En la prctica se utiliza el criterio de

solubilidad.

La solubilidad de una protena en una

concentracin baja de iones aumenta a

medida que se le agrega sal, este fenmeno

es conocido como salting in (Voet et al,

2007) permitiendo que precipiten otras

protenas; pero al agregar ms sales, la

solubilidad de la enzima disminuye

nuevamente. Este fenmeno es conocido

como salting on y resulta en la

precipitacin de la protena (Voet et al,

2007).

En el trabajo realizado por Saeed (2009) se

realiza la purificacin de la enzima fosfatasa

cida de alto peso molecular de hgado de

pollo, en la tabla 1 se muestran los valores obtenidos a partir del fraccionamiento con sales

de sulfato de amonio al 30% y al 60% de saturacin.

Tabla 1. Purificacin de fosfatasa cida de alto peso molecular proveniente de hgado de pollo.Fuente Isolation, purification and characterization of Zn++-dependent acid phosphatase from chickens heartand its comparison with the enzyme of chickens liver(Saeed, 2009).

Ilustracin 2. (a) Se agrega la sal por debajo del punto de

precipitacin de la protena de inters. (b) Luego de lacentrifugacin precipitan protenas no deseadas, se

descartan y se agregan sales en concentracin suficiente

para precipitar la protena de inters. (c) Despus de la

segunda centrifugacin se recupera la protena en el

precipitado. Fuente: Fundamentos de Bioqumica: La

vida a nivel molecular Voet et al2007 .


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RESULTADOS Y DISCUSIONES

Volmenes registrados

Tubos Sob I Sob II Sob III PP I PP II

Volumen (ml) 19.7 19.2 17.9 1.8 4.95

Determinacin de Actividad enzimtica.


Absorbancias Blanco

Muestra0.292 0.253 0.191 0.177 0.392

Muestra 1.078 0.752 0.037 0.023 1.670

Repeticin 1.065 0.739 0.191 0.544 1.680

Promedio 0.7995 0.4925 0* 0.367* 1.283

C.V (%) 0,8579 1,2331 95,5214 129,9480 0,4222

ActividadEnzimtica

16,264 9,764 0,000 0,682 6,558

Clculos: Se utiliza la ecuacin:

A=a.b.c

Donde:

a = Coeficiente de extincin molar del nitrofenolato: 18400 L mol-1

cm-1

b = Longitud de la cubeta: 1cm

c = Concentracin

Para Sob I

(Tubo)

( )

(Volumen Sob I) 19.7

Actividad enzimtica de la fosfatasa cida de Sob I 16.264 UE


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Para Sob II

(Tubo)

( )

(Volumen Sob II) 19.2

Actividad enzimtica de la fosfatasa cida de Sob II 9,764 UE

Para Sob III

Actividad enzimtica de la fosfatasa cida de Sob III 0 UE

Para PP I

(Tubo)

( )

(Volumen Sob I) 1.8

Actividad enzimtica de la fosfatasa cida de PP I 0.682 UE


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Para PP II

(Tubo)

( )

(Volumen Sob I) 19.7

Actividad enzimtica de la fosfatasa cida de PP II 6,558 UE

Determinacin de concentracin de protenas


Absorbancias Muestra 0,099 0,089 0,030 0,043 0,206

Repeticin 0,100 0,089 0,031 0,043 0,198

Promedio 0,0995 0,089 0,0305 0,043 0,202

C.V (%) 0,711 0,000 2,318 0,000 2,800

Concentracin deprotena (mg/ml)

0,435 0,389 0,133 0,188 0,884

Concentracin deprotena en Vol.

obtenido514,70 448,70 143,36 20,32 262,56

Clculos: Utilizando la ecuacin de la curva de calibracin de la prctica pasada sedetermin la concentracin de protenas en los tubos muestra:

Ecuacin: Absorbancia = 0,2285 x Concentracin (mg/ml)

Para Sob I

Absorbancia promedio: 0,0995

0,0995 = 0,2285x

X = 0,435 mg/ml

0,435 mg protena 1ml


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2,613 mg protena 6ml (tubo)

2,613 mg protena 0,1ml (extracto crudo)

514,700 mg protena 19.7 ml (sobrenadante)

Concentracin de protena en el Sob I: 514,7 mg

Para Sob II


0,089 = 0,2285x

X = 0,389 mg/ml


2,337 mg protena 6ml (tubo)

2,337 mg protena 0,1ml (extracto crudo)

448.700 mg protena 19.2 ml (sobrenadante)

Concentracin de protena en el Sob II: 448.7 mg

Para Sob III


0,0305 = 0,2285x

X = 0,133 mg/ml


0.801 mg protena 6ml (tubo)

0.801 mg protena 0,1ml (extracto crudo)


Concentracin de protena en el Sob III: 143.357 mg

Para PP I


0,043 = 0,2285x


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X = 0.188 mg/ml





Concentracin de protena en el PP I: 20.324 mg

Para PP II


0,202 = 0,2285x

X = 0,884 mg/ml





Concentracin de protena en el PP II: 262.556 mg

Tabla de purificacin

Fraccin Volumen (ml)Actividad

(UE)Protena (mg)

Rendimiento

(%)

Act. Especfica

(UE/mg)

Sob I 19.7 16.264 514.70 100,000 0,0316

Sob II 19.2 9.764 448.70 60,038 0,0218

Sob III 17.9 0.000 143.36 0,000 0,0000

PP I 1.8 0.682 20.32 4,194 0,0336

PP II 4.95 6.558 262.56 40,322 0,0250

Despus del homogenizado, el precipitado de este es descartado, ya que la enzima en estudio

se encuentra en solucin para evitar que su centro activo sufra daos y darle estabilidad en el

pH.


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Tomamos como punto de partida al sobrenadante 1, que al saturarse a un 25% con sulfato de

amonio nos permite separar protenas diferentes a fosfatasa cida en el precipitado 1 y

obtener una purificacin parcial de la enzima en la solucin sobrenadante 2. Siendo este

ltimo la muestra a saturar al 55% con sulfato de amonio para aislar la enzima en el

precipitado 2 y quedando as poca o nada de enzima en el sobrenadante 3. Es importante

recordar que para el anlisis espectrofotomtrico es necesario que la muestra se encuentre en

solucin y sea traslcido, por ello, el precipitado 2 debe disolverse en buffer inmediatamente

para evitar que el centro activo sufra cambios conformacionales y mantener el pH estable.

Fuente: Qumica de protenas - UNMSM

Como se muestra en la Tabla 2, mediante la purificacin de esta enzima, se intenta manteneraltos los niveles de actividad enzimtica y disminuir las protenas totales, asimismo, la

actividad especfica final debe ser ms alto que el inicial, ya que la actividad se mantiene y las

protenas totales disminuyen.

En la purificacin parcial llevada a cabo, observamos que en un inicio, el sobrenadante 3 y el

precipitado 1 tienen un error en una de sus repeticiones, ya que al parecer se olvid aadir el

extracto crudo, es por ello que el coeficiente de variacin es ms alto al esperado puesto que

los otros factores se mantuvieron constantes.

Para fosfatasa cida de alto peso molecular, la saturacin que se practica en la tabla 1 est

entre el 30% y 60% de sulfato de amonio (Saeed, 2009); sin embargo, en la purificacin llevada

a cabo en el laboratorio se us una saturacin del 25% y 55% de sulfato de amonio, lo cual nos

debera proporcionar mayor cantidad de protena recuperada en una primera saturacin, esto

se verifica mediante la comparacin entre las actividades especficas de ambos.

Tabla 3: Comparacin de actividades ezpecficas

AE experimental AE ensayo- Saeed

Sobrenadante 1 0,0316 0,037

Sobrenadante 2 0,0218 0,030

Precipitado 2 0,0250 0,034

2


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En ambas pruebas se verifica que la actividad enzimtica es alta, muy a pesar que el volumen

de extracto crudo es distinto, podemos relacionar tambin las actividades especficas ya que su

medida es UE/mg. En nuestro caso, la actividad especfica fue menor al del ensayo de Saeed, a

pesar de que la saturacin usada es un poco menor al de Saeed, esto es debido a errores

humanos en medicin y/o adicin de algn reactivo en la actividad enzimtica y cantidad de

protenas.

Es por ello, que la recuperacin de enzima en el ensayo de Saeed mediante la metodologa de

saturacin con sales es aproximadamente la mitad, mientras que en el nuestro es de 40,3%. Lo

cual, nos indica que para futuras purificaciones, deberamos cambiar la saturacin de la enzima

al 30% y luego al 60%, en el cual se muestra mayor efectividad que el estudiado en el

laboratorio. Sin embargo, a pesar del bajo rendimiento y errores vistos a lo largo del proceso,

se pudo aislar satisfactoriamente a la fosfatasa cida por medio de saturaciones con sulfato de

amonio.

BIBLIOGRAFA

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industria. Reverte, 1995 - 484 pginas. Pg.: 990. Universidad Nacional de Quilmes.

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Molecular.

Fecha de revisin: 08/12/2012.

Disponible en:http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf

Voet, Donald; Voet, Judith G. Bioqumica: 3a edicin. Ed. Mdica Panamericana,

28/08/2006 - 1700 pginas. Pg.: 138

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Saeed, Asma. Tesis: Isolation, purification and characterization of Zn++-dependent acid

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Khan. 2009.Revisado: 08/12/2012.

Disponible en:http://prr.hec.gov.pk/Thesis/315S.pdf

Autor: Mercedes Sobern Lozano, H. Haak, M. Calixto.

Ttulo: Purificacin de fosfatasa cida de alto peso molecular de hgado de cerdo.

Disponible en:

https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/b

ibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid

=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAw

C3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyg
http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdfhttp://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdfhttp://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdfhttp://prr.hec.gov.pk/Thesis/315S.pdfhttp://prr.hec.gov.pk/Thesis/315S.pdfhttp://prr.hec.gov.pk/Thesis/315S.pdfhttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttps://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:5R18mKFNZIEJ:sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/publicaciones/theorema/n6_1995/a09.pdf+&hl=es&gl=pe&pid=bl&srcid=ADGEESibKlCWfCYc_oyukVKjWQduoageaAXIfjN2o30ixIoeB0eIJx_FBg804ds3IDpSoAwC3gSykSMkYmA8kFXJISPtrg8BjfTvqdwlAmssgo37HyvObiumpj1EoIwX0iUkDNsqFX61&sig=AHIEtbTXF2X8IYrEDFe2qeyq6oTK15eKyghttp://prr.hec.gov.pk/Thesis/315S.pdfhttp://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf

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