1º congreso bioquímico del litoral - fundatal...dra. margarita bragós cátedra hematología...

Dra. Margarita Bragós

Cátedra Hematología

FCByF. UNR

[email protected]

[email protected]

Santa Fe, 9, 10 y 11 de junio de 2011

1º Congreso Bioquímico del Litoral

DIAGNÓSTICO

MOLECULAR:

APLICACIONES EN

HEMATOLOGÍA

mailto:[email protected]




Talasemia (+, º)‏

Talasemia (+, º)‏

Hb F aumentada ()º th,

HPFH th

Talasemias

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE TALASEMIAS

IMB

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA

IMB


Se estima que el 3% de la población mundial porta un gen para talasemia

IMB

10 % 20 %

10 %

DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE th


IMB


Valle del Po, Calabria y Sicilia: 10%

Cerdeña y Grecia: 15-20%

IMB

Hb S

10-20 %

< 5 %

40 %

> 20 %

5 % 15 %

DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE HEMOGLOBINOPATÍAS


IMB

HERENCIA


IMB


Datos de nuestro país proporcionados por FUNDATAL

Registro a partir de 1997.

Talasemias mayores: 140

Talasemias mayores c/TMO: 17

Talasemias intermedias: 45

HbS/Talasemia y otras: 55

HBSS: 14

IMB


Curvas de expresión de genes

IMB

Clusters de y Globinas

Patrinos Hum Mut, 2005


IMB

Mutaciones en Talasemia


Esquema del proceso de biosíntesis de la cadena globina. En la fase de Transcripción se

sintetiza el pre-ARNm en el interior del núcleo. Durante el Procesamiento se modifica y acorta el

transcripto primario (splicing). En el citoplasma, por el proceso de Traducción, el ARNm maduro

se pega a los ribosomas para comenzar la síntesis proteica.

IMB

Frameshift º º Splicing

Promotor

RNA cleavage

Small deletion

+

+ º º º º º º º º º º

º º

º º º º º º º º º º º º º º

º º º º º º º º * * * * * * * * * *

8 ag 8 ag 7 gt

7 gt

Cap site

* * Unstable Globin

Nonsense mutation

+ Initatiation codon


1 30 31 104 105 146

5' 3'

LCR LCR

G A 3’ HS1 3’ HS1

Defectos en la transcripción del RNA

Defectos en el procesamiento del RNA

Defectos en la traducción del RNA


IMB



IMB



MUTACIONES QUE AFECTAN AL PROCESAMIENTO DEL ARNm

A.- Mutación en el sitio de unión del CAP: una sola mutación ha sido

encontrada en esta posición.

B.- Mutaciones en el proceso de empalme (splicing)‏

1. - Mutaciones en las secuencias donadora o aceptora para el splicing:

IVS1-1 GA, IVS2-l GA (0 –talasemia).

2. - Mutaciones en los exones (mutación sin sentido): Hb Malay (19 GA),

HbE (26 G A) y Hb Knossos (27 G T) (+ -talasemia)‏

3. - Mutaciones en los intrones que originan un lugar alternativo para el

splicing: IVS1-6 TC, IVS1-110 GA; IVS2-745 (+ talasemia). ,

C.- Mutaciones que afectan a la escisión y poliadenilación

IMB



MUTACIONES EN EL PROCESO DE TRADUCCIÓN

A.- Codon de iniciación: en la posición 49 a la izquierda del sitio CAP,

aparece un codon AUG que corresponde a la señal para iniciar la

traducción. Las posibles mutaciones que se originen en este codon,

suprimen la traducción y originan una 0-talasemia.

B.- Terminación prematura

1. - Mutación sin sentido: la sustitución de una de las bases de un triplete

que codifica a un aminoácido, origina uno de los tres codones de

terminación (UAG, UAA y UGA) lo cual da lugar a la terminación

prematura de la traducción del ARNm. CAGTAG en el codon 39 (0 –

talasemia).

2. - Frameshift (Alteración del marco de lectura): inserciones o deleciones

de 1, 2 o 4 nucleótidos en la región codificadora del gen globina (0 –

talasemia). IMB


CORRELACIONES GENOTIPO-FENOTIPO

Cualquier condición heredada o adquirida que reduce el desbalance de

cadenas de globina alpha/no-alpha en ß-talasemia resulta en un menor

grado de precipitación de cadenas de globina alfa y conduce a un fenotipo

menos manifiesto [Galanello & Cao 1998].

•El cuadro clínico que resulta de la homocigosidad ß+ -talasemia u

homocigosidad para ßº-talasemia puede ser mejorado por la co-herencia

de mutaciones en el gen que codifica la cadena de alfa globina, lo que

reduce la producción cadenas de alfa globina y por lo tanto disminuye la

relación alpha/no-alpha.

•ß-talasemia Heterocigota puede en algunas circunstancias dar una

fenotipo de talasemia intermedia en lugar del carrier asintomático.

Triplicación o (menos frecuentemente) cuadruplicación del gen alpha

(/ o / o /), lo que aumenta el desbalance en la

relación de cadenas alpha/no-alpha.

IMB

http://www.geneclinics.org/servlet/access?qry=156&db=genestar&fcn=term&gtreport2=true&id=8888891&key=VyNfsADVjzQjp&format=frame

http://www.geneclinics.org/servlet/access?id=8888891&key=VyNfsADVjzQjp&gry=INSERTGRY&fcn=y&fw=Rbhe&filename=/glossary/profiles/b-thal/

http://www.geneclinics.org/servlet/access?id=8888891&key=VyNfsADVjzQjp&gry=INSERTGRY&fcn=y&fw=Rbhe&filename=/glossary/profiles/b-thal/







Técnicas Moleculares para Screening de Talasemia

y Hemoglobinopatías

Patrinos Hum Mut, 2005 IMB

Exon 1 Exon 2 Exon 3 IVS 1 IVS 2

1 30 31 104 105 146

(634 bp)‏ IVS-2 nt 1

(436 bp)‏ Codon 39

(390 bp)‏ IVS-1 nt 110

(286 bp)‏ IVS-1 nt 6

(281 bp)‏ IVS-1 nt 1

Primer

Common

PCR-ARMS


The Lancet 1990; 336:834-37 IMB

+ 1-110 / 0 39 Talasemia

1 2 3 4 1 2 3 4

Línea 1: control de contaminación, H2O

Líneas 2 y 4: 100 bp ladder

a- Líneas 3 y 4: doble-heterocigota IVS-1-nt110 con primer normal y mutado (390 bp)

b- Líneas 2 y 3: doble-heterocigota CD39 con primer normal y mutado (436 pb).

a b

500bp

861bp

390bp

861bp

436bp

IVS-1-nt110 CD39

PCR-ARMS


IMB

- Talasemia

DOT-BLOT

B2, C1 y D1 son heterocigotas para IVS 1-110


IMB

Espectro de mutaciones de - Talasemia en el Mediterráneo, Brasil y Argentina

CD 39 %

IVS 1-110 %

IVS 1-1 %

IVS 2-745 %

IVS 1-6 %

IVS 2-1 %

? %

Argentina 57,4 22,1 4,9 4,1 2,5 1,6 7,4

Argentina 47 22,4 9,4 5,9 15,3

Italia 40,1 23,0 10,2 5,0 9,9 12

Cerdeña 95,7 0,5 0,03 0,4 0,10 0,03

España 64 8,5 2,5 15,5

Portugal 52,6 10,7 32,9

Francia 41,9 25,7 10,5 2,8 8,6 1,0

Brasil 64,3 20,0 5,7 0 7,1 2,9


IMB

Espectro de mutaciones de - Talasemia en Rosario

MUTACIONES Nº DE ALELOS % FENOTIPO

IVS-1-nt l (G A)4,9 6 ‏ º

IVS-1-nt 6 (T C)2,5 3 ‏ +

IVS-2-nt l (G A)1,6 2 ‏ º

IVS-1-nt 110 (G A)22,1 27 ‏ +

IVS-2-nt 745 (C G)4,1 5 ‏ +

CD39 (C T)57,4 70 ‏ º

Desconocidos 9 7,4

Total 122 100

Origen de los pacientes: 89,3 % italianos; 9,8 % españoles; 0,9 % griegos

Bragós et al. Haematologica, 2000


IMB

HETEROGENEIDAD MOLECULAR DE LA -TALASEMIA

Autores Mutaciones

estudiadas

% de alelos

identificados

Bragós, I 6 92,6

Rosatelli, MC (Italia) 5 88

Martins, C (Brasil) 4 97,1

Villegas, A (España) 5 86,6

Varela, V

(Argentina)´96

4 90

Varela, V

(Argentina)´99

6 90

Roldán, A

(Argentina)

4 84,7


IMB

Mutaciones más frecuentes en el gen beta en poblaciones de riesgo

-88 CT, -29 AG, IVS1-5 GT, cd 24

TA, IVS11-849 AG, AC

75-80%

African / African-

American

-28 AG, 17 AT, 41/42 -TTCT, IVS2-

654 CT

Chinese

-28 AG, 17 AT, 19 AG, IVS1-5 GC,

41/42 -TTCT, IVS2-654 CT

Thai

-619 bp deletion, cd 8/9 + G, IVS1-

1 GT, IVS1-5 GC, 41/42 - TTCT

91-95% Indian

cd 8 -AA, cd 8/9 + G, IVS1-5 GC,

cd 39 CT, cd 44-C, IVS2-1 GA

Middle East

IVS1-1 GA, IVS1-6 TC, IVS1-

110 GA, IVS2-l GA , cd 39

CT, IVS2-745 CG

Mediterranean


IMB




Deleciones causantes de Talasemia y Persistencia Hereditaria

de Hemoglobina Fetal

IMB

()0 Siciliana

1- Control normal

2- Control positivo heterocigota

3- Paciente positivo heterocigota

4- Blanco de reacción

5- Marker

1 2 3 4 5

1585 pb

1150 pb

IMB

Talasemia Intermedia. Co-herencia de triplicación de genes α y th

(a) + II-745/ anti 3,7 (b) 0 39/ anti 3,7

32.2 17.1 53 27 8.6 (b) 5.0

30.9 15.8 51 28.5 8.8 (a) 5.7

MCHC

(g/dl)‏

MCH

(pg)‏

MCV

(fl)‏

Hct

‏(%)

Hb

(g/dl)‏

RBC

(1012/l)‏


IMB

ASOCIACIÓN DE -TALASEMIA HETEROCIGOTA (CD 39)

CON DELECIÓN -3.7

GR

(1012

/l)

Hb

(g/dl)

Hto

(%)

VCM

(fl)

HCM

(pg)

CHCM

(g/dl)

4.9 11,2 37 75 22,8 30,3

1 2 3 4 5 6

1,76 kb


IMB

PORTADORES DE TALASEMIA

GR

(1012

/l)

Hb

(g/dl)

Hto

(%)

VCM

(fl)

HCM

(pg)

CHCM

(g/dl)

(a) 4,87 10,5 36 73,9 21,5 29,1

(b) 4,84 10,0 31,5 65 20,7 31,7


CD39 (0)

Hb A2 2,2 % (a), 2,4 % (b)

Hb F de 7,2 % (a), 13 % (b)

IMB

Hb S con talasemia º39

32.0 26 80 24 7.8 3.34

MCHC

(g/dl)‏

MCH

(pg)‏

MCV

(fl)‏

Hct

‏(%)

Hb

(g/dl)‏

RBC

(1012/l)‏

Reticulocitos: 17.8 %

Hb A2: 6%, Hb F: 14 %, Hb S: 80%


IMB

Talasemia Mayor: Co-herencia de + 1-110 / º 39

Reticulocitos: 12 %

Hb A2: 2.9 %, Hb F: 46 %

31.6 20.5 65 38 12.1 5.90

30.4 17.6 58 34 10.2 5.78

32.4 20.4 63 21 6.7 3.29

RBC MCH

(pg)‏

MCV

(fl)‏

Hct

‏(%)

Hb

(g/dl)‏

RBC

(1012/l)‏

Papá

Mamá

Propósito


IMB

Clusters de y Globinas

Patrinos Hum Mut, 2005

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ALFA TALASEMIA

IMB

80 %

5 - 10 %

20 - 30 %

80 %

DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE th


IMB

α TALASEMIA

Los alelos talasémicos (-/) (--/) (T/) de los progenitores

portadores se combinan en sus diferentes posibilidades dando

distintos genotipos

IMB

Diagnóstico Molecular de Talasemias


IMB

-4.2

-3.7

- 70 kb 0 kb 10 kb 20 kb 30 kb

5’HVR‏‏HS-40 2 inter HVR 1 1 2 1 1 3’HVR

5’ 3’

-5.2

--MED

--THI

--SEA

--BO

230 kpb 60 kpb

30 kpb 35 kpb

--DUCH

Deleciones causantes de -talasemia

IMB

- 70 kp 0 kp 10 kp 20 kp 30 kp

5’HVR‏‏HS-40 2 inter HVR 1 1 2 2 1 1 3’HVR

Nco Hph CS T Saudí

CAP Poly A signal

1 31 32 99 100 141

5' 3'

CAT ATA box box

1) Mutaciones en el procesamiento del RNA

Mutaciones puntuales causantes de -Talasemia

2) Mutaciones en la traducción del RNA

3) Mutaciones que causan

inestabilidad post-transcripcional

Mutaciones en el sitio de splicing

Mutaciones en la señal de poliadenilación

Mutaciones en el codon de iniciación

Mutaciones en el codon de terminación

Mutaciones Frameshift

Mutaciones sin sentido

IMB

Hph I Hph I Hph I Hph I

2

1

C8 C3

ARNm Cap site

1078

163 322

Amplificación del gen 2 y análisis

con enzimas de restricción

IMB

Hph I Hph I Hph I

2

1

C8 C3

ARNm Cap site

1400

163



IMB

Nco I

2

1

C8 C3

ARNm Cap site

1094 894



IMB

2

1

C8 C3

ARNm Cap site

1998



IMB

2

1

C8 C3

ARNm Cap site

Mse I Mse I Mse I

1379 401

163



IMB

564

2

1

C8 C3

ARNm Cap site

Mse I Mse I

1379



IMB

2

1

C8 C3

ARNm Cap site

Mse I Mse I Mse I

1379 401

163



IMB

1379

564 461 163

Mse I Nco I Hph Mse I Nco I HphI

Patient Control

φ x 174 RF.

1353

603

Electroforesis en gel de acrilamida: los fragmentos obtenidos corresponden a un

homocigota para una mutación en el codon de terminación del gen 2: Hb Cs-Sp

(TAA CAA).

IMB

--MED

- 70 kb 0 kb 10 kb 20 kb 30 kb


5’ 3’

Gap- PCR: Deleción --Med

IMB

1- pUC Mix Marker 8

2– Control Positivo

3- Propósito

4- Mamá

5- Papá

6- Hermano

7- Hermano

861 pb

561 pb

1 2 3 4 5 6 7

1118 pb

692 pb

Deleción --Med

IMB

--20.5

- 70 kb 0 kb 10 k b 20 kb 30 kb


5’ 3’

GAP-PCR: Deleción -20.5

IMB

Deleción -20.5

861 pb 615 pb

1 2 3 4 5 6 7 8

1118 pb

692 pb

1- pGEM DNAMarkers

2- Control Positivo

3- Propósito

4- Mamá

5- Papá

6- Hermano 1997

7- Hermano 1994

8- Control de contaminación

IMB

1 2

5’ 3’

3.7 kb

GAP-PCR: Deleción -3.7

IMB

Deleción -3.7

1-9- pGEM DNAMarker

2-3- Control Positivo

4-5- Propósito

6-7- Mamá

10-11 Papá

12-13 Hermano 1997

14-15 Hermano 1994

8-16 control de contaminación

1.76 kb

1.76 kb

9 10 11 12 13 14 15 16

N M N M N M

N M N M N M

1 2 3 4 5 6 7 8

2.64 kb 1.60 kb

IMB

Morfología eritrocitaria

Mamá Papá

Propósito

IMB

Datos Hematológicos

Aniso++, Micro++,

Hipo++, Elip+,

Ovalo, TC+

141.4

0.6

30.5 / 16

65.8 / 20.0

13.3

6.62

/--20.5

Papá

Aniso+,

Hipo+

4.1

2.0

34.5 / 14.2

81.1/ 28.0

10.8

3.87

/-3.7

Mamá

Aniso+++,

Micro++, Macro+,

Hipo++, Elip+,

Oval+, Esquis+,

TC++

72.4

1.0

31.3 / 22.4

57.7 / 18.0

8.8

4.88

--/-3.7

Propósito

Aniso+

32.6

0.8

33.9 / 12.8

86.6 / 29.3

13.7

4.67

/

Hermano

1997

Aniso+,

Hipo+,

Micro+,

Oval+

44.2

1.9

35.3 / 12.9

79.2 / 28.0

12.8

4.58

/-3.7

Hermano

1994

Genotipo

RBC x 1012/L

Hb g/dl

Reticulocitos %

Morfología

Ferritina

CHCM g/dl /

RW %

MCV fl/ MCH pg

+++: marcada; +: ocasional; -: negativo

hip: hipocromía, aniso: anisocitosis, macro: macrocitos, micro: microcitos, oval: ovalocitos, elip:

eliptocitos, esquis: esquistocitos, TC: target cells

IMB

Prevalencia de talasemia -3.7 en Argentina

Genotipo n Prevalencia

(/) 303 97,74 %

(-3.7/) 6 1,94 %

(-3.7/-3.7) 1 0,32 %

Noguera et al Hemoglobin, 2002 IMB

Valores hematológicos promedio de acuerdo al

genotipo

IMB

Desarrollo de una tira ELISA para la detección de talasemias Detección de Hb de Bart en soluciones de Hb mediante mAb altamente

específico .

Sensibilidad (93.4%), especifidad (93,7).

Published online 22 October 2009

Haematologica | 2010; 95(2)

167 sujetos con alfa talasemia

8 muestras positivas por Elisa no pudieron ser

genotipificadas por PCR

IMB

http://www.haematologica.org/cgi/content/full/95/2/338/F10950338

Pruebas de Genética Molecular: Usos Clínicos

•Diagnóstico Molecular para identificar:

oMutaciones puntuales específicas causantes de la enfermedad en el

gen que codifica la cadena beta de la hemoglobina

oDeleciones de extensión variable del gen ß o del cluster, que resultan

en ß-talasemia o en ß-talasemias complejas denominadas ß-talasemia

y ß-talasemia. Nota: las Deleciones son raras causas de ß-talasemia.

•Testeo de Portadores

•Diagnóstico Prenatal

•Pronóstico: predicción de la severidad clínica

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE TALASEMIAS

IMB

















El diagnóstico prenatal para identificar la anemia del

Meditarráneo en el feto

-DNA de vellosidad corial: 10-12 semanas de embarazo

-Tener identificadas las mutaciones que afectan a ambos

integrantes de la pareja

-Este estudio permite conocer la situación genética del

feto, pero, en este momento, no hay posibilidad de una

intervención terapéutica para una posible afección fetal.

DIAGNÓSTICO MOLECULAR TALASEMIAS

IMB

Diagnóstico Pre-implantación

Técnica pre-concepción

Recolección de oocitos no fertilizados de la mujer portadora de β-thal. Durante las diferentes fases de maduración, el oocito expele el 1° y el 2°

cuerpo polar. El analisis del DNA de uno de esos cuerpos polares,

implicando que si la mutación talasémica está presente en el cuerpo polar,

no está mas presente en el oocito, permite la selección del oocito sin la

mutación talasémica y por lo tanto la fertilización in vitro para la

implantación en el útero.

DIAGNÓSTICO PRENATAL DE BETA TALASEMIA

IMB

Recientemente se han identificado mutaciones puntuales

responsables de β-talasemia y anemia drepanocítica en

células fetales obtenidas de sangre materna (19 células

fetales en 16 ml de sangre materna) mediante separación de

los mononucleares en un gradiente de densidad,

enriquecimiento de las células fetales usando anticuerpo anti

receptor de transferrina, identificación de las mismas por

medio de anticuerpos anti Hb fetal, aislamiento de glóbulos

rojos nucleados por microdisección bajo microscopía óptica y

análisis por PCR (Cheung et al, 1996). La simplificación y la

automatización parcial de este procedimiento permitirá la

introducción del diagnóstico prenatal mediante análisis de

células fetales en circulacuón materna en la práctica clínica.


IMB

El mayor problema con la terapia génica ha estado

relacionado con la construcción del vector. El gen

terapéutico debe ser insertado en una célula

hematopoyética y debe ser expresado a altos niveles, por

un período de tiempo extendido, de forma eritroide

específica; el vector debe ser seguro con respecto a

recombinación o mutagénesis.

Vectores lentivirales que portan un pequeño gen RNA

nuclear que codifica un RNA antisense han demostrado

que corrigen los defectos de splicing causados por las

mutaciones talasémicas (forzando la selección de sitios de

splice normal).


IMB

-Screening de Beta Th en 23.485 sujetos (2000-2006)‏

-3.934 tenían HbA2 borderline (3,1 – 3,9%).

-410 muestras (con fenotipo normal o de portador ) estudiadas por PCR por tener

parejas portadoras de beta Th clásica.

-De estos sujetos, 94 (22.9%) fueron positivos para un defecto molecular en el gen

β, ó . El defecto molecular mas prevalente fue β IVS1 nt 6, co-herencia de

mutaciones severas de β y talasemia, mutaciones en el promotor β‏y‏ triplicación

de genes alfa y algunas Hbs Variantes.

-Ningún defecto molecular fue encontrado en los restantes 316 individuos. IMB

Molecular Biology in heterozygous beta Thalassemia diagnosis

XXXI World Congress of the International Society of Hematology 2007

March 20-24, 2007- Punta del Este - Uruguay

-Mujer con: GR 4,9 x 1012/l, Hb 11,7 g/dl, Hto 37%, VCM. 73,7 fL, HCM 23,4 pg.

Serie roja: microcitos hipocrómicos. Estudio de Hierro: normal.

HbA2 3,8%; Hb F 1%.

-La elevación de Hb A2 es la característica más importante en la identificación

de Th heterocigotas. Sin embargo algunos portadores pueden tener Hb A2

normal o en el límite inferior del rango para un portador.

-En 124 portadores de Th identificamos tres individuos con la mutación + I-6;

Hb A2 5,5; 5,6 y 4,9 %.

-Altay y col encontraron que el aumento de Hb A2 no se correlaciona con la

severidad de la mutación responsable de talasemia; Stefanis L y col

encontraron valores más bajos de Hb A2 en pacientes portadores de la

mutación + 1-6.

-PCR-ARMS + 1-6: positivo Bragós et al., 2007 IMB

¡¡¡MUCHAS GRACIAS!!!

IMB

1º congreso bioquímico del litoral - fundatal...dra. margarita bragós cátedra hematología...

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