1 asignatura: anÁlisis quÍmico grado: ciencia y tecnología de los alimentos curso académico:...
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Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICOGrado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Curso académico: 2012/13
1. Introducción- Fluorescencia, Fosforescencia, Quimioluminiscencia
- Características analíticas
2. Teoría de la Fluorescencia y Fosforescencia
3. Tipo de espectros
4. Variables que afectan a la Fluorescencia– Fluorescencia y estructura
– Fluorescencia y entorno químico
– Fluorescencia y concentración
5. Instrumentación
6. Aplicaciones al análisis de alimentos
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Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICOGrado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Curso académico: 2012/13
CONTENIDOS
Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICOGrado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Curso académico: 2012/13
1. Introducción
Métodos luminiscentes moleculares
Fluorescencia Fosforescencia Quimioluminiscencia
A A* A + hδ
Espectro de emisión
Análisis cualitativo
Análisis Cuantitativo
Absorción de fotones (hδ )
Reacción química
• Basados en la emisión de radiación electromagnética por moléculas que previamente han sido excitadas.• Cada especie A emite radiaciones de λ características Análisis cualitativo• La intensidad de la radiación IF es proporcional a la [A] Análisis cuantitativo
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1. Introducción
• La fluorescencia es un fenómeno que fue conocido en el siglo XIX por Stoke: observó fluorescencia en el mineral de fluorita .
Bajo luz del sol Bajo luz ultravioleta
Agua tónica
• El agua tónica es un refresco carbonatado aromatizado con quinina. La quinina es un alcaloide de sabor amargo que se extrae de la corteza del árbol de la quina, y tiene propiedades antipiréticas, analgésicas y contra la malaria.La quinina es una sustancia fluorescente
Luz UV Luz λ mayor
Excitación Emisión
Fig. 1
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Fig. 2
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CaracterísticasCaracterísticas
• Sensibilidad (ppb)Sensibilidad (ppb)
• Gran intervalo linealGran intervalo lineal
• SelectividadSelectividad
• Menor aplicabilidad que los métodos Menor aplicabilidad que los métodos de absorciónde absorción
•Mayor interferencia ambientalMayor interferencia ambiental
Características analíticas
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1. Introducción
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2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia
A + hδexcitación A* A + hδemisión hδexcitación hδemisión
λexcitación λemisión
E0
E1
hδexcitación hδemisión
Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia.
•Estado electrónico molecular singlete: los espines de los e- están apareados
•Estado electrónico molecular triplete: los espines de los e- están desapareadosEstado
singletefundamental
Estado singleteexcitado
Estado tripleteexcitado
Fluorescencia Fosforescencia 6
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Diagrama parcial de energía para un sistema fotoluminiscente2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia
Estados singletes excitados Estados tripletes
excitados
Cruce entre sistemas
Fosforescencia
T1
Fluorescencia
Relajación vibracional
Conversión interna
S2
S1
Absorciónexcitación
S0
Estado fundamental
Ener
gia
Conversión interna
Relajación vibracional
λ2 λ1 λFλP
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La velocidad a la que un fotón de radiación es absorbido es grande: el proceso requiere del orden de 10-14 a 10-15 s
La emisión fluorescente, tiene lugar a una velocidad relativamente más lenta, entre 10-9 a 10-5 s, y depende inversamente de la absortividad molar del pico de absorción correspondiente al proceso de excitación
La emisión fosforescente requiere tiempos del orden de 10-4 a 10 s ó más.
Velocidad de absorción y de emisión
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2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia
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El camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado
FLUORESCENCIA: emisión de FLUORESCENCIA: emisión de un fotón de radiaciónun fotón de radiación
RELAJACIÓN VIBRACIONAL: no radianteRELAJACIÓN VIBRACIONAL: no radiante
CONVERSIÓN INTERNA: no radianteCONVERSIÓN INTERNA: no radiante
CONVERSIÓN EXTERNA: no radianteCONVERSIÓN EXTERNA: no radiante
CRUZAMIENTO ENTRE SISTEMAS: no radianteCRUZAMIENTO ENTRE SISTEMAS: no radiante
FOSFORESCENCIA: emisión de un fotón de FOSFORESCENCIA: emisión de un fotón de radiaciónradiación
Procesos de desactivación
Estado excitado
Estado fundamental
La fotoluminiscencia sólo la presentan un número relativamente pequeño de sistemas con características estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivación no radiantes sean mas lentos que los de emisión.
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2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia
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• Espectro de excitación: Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia, manteniendo fija la λemisión y variando la λexcitación
• Espectro de emisión : Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia manteniendo fija la λexcitación y variando la λemisión.
• Los análisis se efectúan seleccionando λexcitación y λemisión máximas.
FenantrenoFenantreno
Excitación Emisión Fluorescente
Emisión Fosforescente
Espectros de excitación y emisión de fluorescencia y fosforescencia
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3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia
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Espectros de excitación y emisión de fluorescencia
Cada uno es una imagen especular del otro.Las emisión son mayores que excitación
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3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia
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Antracenoa) espectro excitaciónb) espectro fluorescente
Cada uno es una imagen especular del otro
Espectros de excitación y emisión de fluorescencia
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3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia
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4. Variables que afectan a la fluorescencia
Estructura química
Entorno químico
Sustancia fluorescente
Intensidad de emisión fluorescente
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= nº moléculas que emiten fluorescencia/nº total de moléculas excitadas = nº fotones emitidos/nº fotones absorbidos
KF, Kpd, Kd Estructura química
Kces, Kce, Kci Entorno químico
Rendimiento cuántico de fluorescencia:
K = las constantes de velocidad de los diversos procesos de desactivación posibles: fluorescencia (KF), cruce entre sistemas (Kces), conversión externa (Kce), conversión interna (Kci), predisociación (Kpd) y disociación (Kd ). Las variables que conducen a valores altos de KF y valores bajos del resto de velocidades exaltan la fluorescencia
= KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd
Rendimiento cuántico y tipo de transición:La eficacia cuántica es mayor para las transiciones -*
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4. Variables que afectan a la fluorescencia
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Fluorescencia y estructura
Pueden presentar fluorescencia:• Compuestos con estructuras con dobles enlaces altamente conjugados.
• Compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas
• La fluorescencia más intensa es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones π → π* de baja energía
• La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución.• La eficacia cuántica normalmente aumenta con el número de anillos y con su grado de condensación
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4. Variables que afectan a la fluorescencia
Fig. 1 Fig. 2
Antraceno
Fenantreno
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NN
N O S
N
H
N
H
Piridina Furano Tiofeno Pirrol
Quinoleina Isoquinoleina Indol
Heterociclos sencillos no fluorescentes
Fusionados con anillos bencénicos sí presentanfluroescencia
Fluorescencia y estructura
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4. Variables que afectan a la fluorescencia
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La sustitución en el anillo bencénico produce:• Desplazamientos de la de los máximos de excitación y emisión• Un aumento o disminución de la intensidad de fluorescencia según el sustituyente
Efecto de la sustitución en la fluorescencia del benceno
Compuesto
Fórmula
Longitud de onda de la fluorescencia, nm
Intensidad relativa de la fluorescencia
Benceno C6H6 270-310 10 Tolueno C6H5CH3 270-320 17 Propilbenceno C6H5C3H7 270-320 17 Fluorobenceno C6H5F 270-320 10 Clorobenceno C6H5Cl 275-345 7 Bromobenceno C6H5Br 290-380 5 Iodobenceno C6H5I - 0 Fenol C6H5OH 285-365 18 Ión fenolato C6H5O
- 310-400 10 Anisol C6H5OCH3 285-345 20 Anilina C6H5NH2 310-405 20 Ión anilinio C6H5NH3
+ - 0 Ácido benzóico C6H5COOH 310-390 3 Benzonitrilo C6H5CN 280-360 20 Nitrobenceno C6H5NO2 - 0
Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes
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4. Variables que afectan a la fluorescencia
Los electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y –OR, aumentan la eficacia de la fluorescencia desplazándola a mayores
Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y –NO2,reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transición n- *.
Los halógenos producen efecto de átomo pesado interno
Los grupos sulfónicos no modifican significativamente la fluorescencia
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Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes
4. Variables que afectan a la fluorescencia
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CH HFluoreno Bifenilo
= 1 = 0,2
• La fluorescencia aumenta con la rigidez molecular. • La emisión fluorescente aumenta cuando los colorantes fluorescentes se adsorben en una superficie sólida ya que aumenta su rigidez: Indicadores de adsorción
• La influencia de la rigidez también explica el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgánicos cuando forman complejos con iones metálicos. • Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de la 8-hidroxiquinoleína es mucho menor que la de su complejo de zinc
Fluorescencia y estructura. Efecto de la rigidez estructural
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4. Variables que afectan a la fluorescencia
• TemperaturaUn aumento de temperatura provoca disminución de I F
Fluorescencia y entorno químico
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IF Temperatura ºC
• DisolventeLa fluorescencia de una molécula disminuye en presencia de disolventes que contengan átomos pesados: tetrabromuro de carbono, yoduro de etilo
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4. Variables que afectan a la fluorescencia
• pHInfluye en la fluorescencia de compuestos aromáticos con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo.
N
H H+
N
H H
: N
H H+
N
H H H+
Anilina Ión anilinio
Fluorescencia y entorno químico
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IF = 0If = 20
• Oxígeno disueltoReduce la intensidad de fluorescencia de una disolución
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4. Variables que afectan a la fluorescencia
Fluorescencia y concentración
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• La intensidad de emisión fluorescente (IF) es proporcional a la potencia radiante de la luz incidente (P0) y a la concentración de la especie fluorescente (c), si la absorbancia de la disolución es pequeña a las longitudes de onda de excitación y de emisión .
IF = k P0 cIF = K c
Relación entre la intensidad de fluorescencia y la concentración
Al aumentar P0 aumenta IF Análisis de trazas
Para concentraciones de analito altas, IF deja de ser proporcional a c
Análisis cuantitativo
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4. Variables que afectan a la fluorescencia
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5. Instrumentación
Esquema de un espectrofluorímetro
en ángulo recto
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Fuente deradiación
Monocromadorde excitación
Cubeta de muestra
Monocromadorde emisión
Detector
Registradoro PC
Muchaslongitudes de onda
Una longitud de onda
λexc
λemUna longitud de onda
Luminiscencia a muchaslongitudes de onda
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Detectores
• De mayor potencia que las que se utilizan en absorción. • La energía radiante emitida en fluorescencia es directamente proporcional a la intensidad de la fuente. • Lámpara de arco de mercurio, • Lámpara de arco de xenón,• Láseres de N2 o de Ar
Cubetas
Selección ex y em • Filtros: fluorímetro• Monocromadores : espectrofluorímetro
Fuente de luz
•Vidrio o cuarzo
•Rectangulares, con las cuatro caras pulimentadas
Tubos fotomultiplicadores.
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5. Instrumentación
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6. Aplicaciones
Análisis cualitativo• Poca aplicación.• la fluorescencia es valiosa en la identificación de derrames de petroleros.
Análisis cuantitativoLa aplicación más importante de la fluorimetría corresponde al análisis de productos alimenticios, sustancias farmacéuticas, muestras clínicas y productos naturales
• Los métodos fluorescentes son :• Aplicables a intervalos de concentración más bajos los de absorción • Tienen sensibilidades mayores que los métodos de absorción. •Tienen una precisión y exactitud menor que las de los de absorción.•Muy selectivos, con una selectividad mayor que los métodos de absorción.
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•Los basados en la reacción del analito con un agente de complejación para formar un complejo fluorescente. Se utilizan para cationes
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Análisis cuantitativo
Determinación de especies inorgánicas
Se han desarrollado métodos cuantitativos basados en fluorescencia para especies inorgánicas, orgánicas y bioquímicas.
Los indirectos, basados en la disminución de la fluorescencia, quenching, como resultado de la interacción del analito con un reactivo fluorescente. Se utilizan para aniones y determinación de oxígeno en disolución.
• Determinación de Al (III)El granate de alizarina R permite detectar Al3+ a niveles de 0,007 µg/mL.GAR + Al (III) GAR - Al (III)
Determinación de anión F-, se basa en la desactivación de la fluorescencia del complejo GAR - Al (III)GAR - Al (III) + F- GAR + Al(III)-F
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6. Aplicaciones
Determinación de sustancias orgánicas y bioquímicas
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Análisis cuantitativo
•El número de aplicaciones de los métodos fluorimétricos a problemas orgánicos es muy elevado •Pueden determinarse por fluorescencia los aminoácidos, proteínas, coenzimas, vitaminas, ácidos nucleicos, alcaloides, porfirinas, esteroides, flavonoides, la adenina, ácido antranílico, hidrocarburos policíclicos aromáticos, cisteína, guanina, isoniazida, naftoles, ácido salicílico, triptófano, ácido úrico y numerosos metabolitos.
• También muchos agentes medicinales pueden determinarse por fluorimetría, como la adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procaína, reserpina y dietilamida del ácido lisérgico (LSD).
• La aplicación más importante de la fluorimetría corresponde al análisis de productos alimenticios, sustancias farmacéuticas, muestras clínicas y productos naturales.
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6. Aplicaciones
• Determinación de cationes y aniones• Determinación de quinina• Determinación de colorantes• Determinación de pesticidas• Determinación de vitaminas
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Aplicaciones al análisis de alimentos
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6. Aplicaciones
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-Logo encabezado páginas OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia. Dirección web: http://ocw.um.es..-Página 4. Fig. 1. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FluoriteBerbes.jpg. Author: Didier Descouens.-Página 4. Fig. 2. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tonic_water_uv.jpg. Author: User:Splarka from en:wp-Página 15, Fig. 1. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/w/index.php?title=File:Anthracene_acsv.svg&page=1. Author: Calvero.-Página 15, Fig. 2. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fenantrene.PNG.
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