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12/06/2014

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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E11

RECUPERACION Y PURIFICACION DE MACROMOLECULAS

Docente a cargo: Fernando Oliver ([email protected])

CEBI_E11_3 : Filtración

Filtración

•Es una operación unitaria por la cual se produce la separación de un sólido (o un soluto) de un fluido (liquido o gaseoso) por acción de un medio filtrante y una diferencia de presión.

•La fuerza impulsora a través del filtro es la diferencia de presión.

Filtración

• La fuerza impulsora en la filtración es la diferencia de presión.

• Como puedo generar esa presión:

• Presurizando un tanque (usada en producción)

• Filtrando con una bomba (usada en producción)

• Haciendo vacio (mas usada en escala laboratorio)

Clasificación por modo de operación

• Filtración Normal:• El flujo es perpendicular a la membrana

filtrante.

• Filtración Tangencial• El flujo es tangencial a la membrana

filtrante.

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Clasificación según producto

• Filtración con formación de torta (cake filtration)• Se recupera el material solido que se acumula

sobre el filtro (ej: levaduras)

• Clarificación• En esta filtración el producto es el filtrado que

atraviesa el filtro (ej: sobrenadante post lisis)

Clasificación según tiempos de operación

• Trabajo en batch• Filtro prensa

• Trabajo en continuo• Filtro rotatorio al vacio

Filtros prensa

Video filtro prensa: https://www.youtube.com/watch?v=g7vump_1zwA

Aplicación en biotecnología: producción de levaduras.

Tambor rotatorio

Video Tambor rotatorio: https://www.youtube.com/watch?v=29FGhBp7juQ

Aplicación en biotecnología: bioremediacion.

Armazón de tipo tambor, cubierta con tela de filtro . En el interior se divide en cámaras radiales a las cuales se les aplica el vacío (250 - 300 mm Hg) .

El tambor rota (0.1 - 2 rpm) parcialmente sumergido en un baño agitado

La aplicación del vacío a las cámaras sumergidas hace que el material pase a través de la tela filtrante acumulandose el solido sobre la membrana.

Cuando la superficie del tambor cubierta de sólidos sale fuera del baño, se produce un lavado y después se elimina la capa de sólidos depositada mediante una cuchilla raspante.

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Clasificación según el mecanismo

Filtración superficial (formación de torta)

Las partículas son retenidas en la superficie del filtro, no entran al medio de filtración.

Filtración de profundidad

Las partículas pueden penetrar en el filtro. Son retenidos en el filtro por tres mecanismos:

la interceptación directa, impacto inercial intercepción de difusión.

Determinación área filtrante

Método Vmax

Se basa en el modelo de taponamiento progresivo del filtro.

Este modelo asume que el taponamiento de los poros de la membrana es uniforme y progresivo en el tiempo.

Vmax es el volumen máximo que se podría filtrar con un sistema a tiempo infinito.


Método Vmax

La ecuación que se utiliza en este modelo es :

•Los valores Vmax y Qi se obtienen experimentalmente graficando t/V = f (t).

t

Vmax

t

V

1

Qi= +

t = tiempo de procesoV= volumen a filtrar (L)Vmax=volumen maximo filtrable a tiempo infinito (L)Qi = Flujo volumetrico inicial (L/min)


Determinación experimental de Vmax.

Se realiza la filtración del material a presión constante registrando como varia el flujo de permeado en el tiempo

Se realiza en un tiempo de aprox. 10 min y con una membrana pequeña (ej: 47 mm, Área = 17,35 cm2)

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Determinacion area filtrante

Ejemplo calculo de Vmax:

Tiempo (min) Volumen (L) t/V (min/L)

0,5 0,065 7,692

1,0 0,106 9,434

1,5 0,138 10,870

2,0 0,164 12,195

2,5 0,185 13,514

3,0 0,203 14,778

3,5 0,219 15,982

4,0 0,232 17,241

4,5 0,245 18,367

5,0 0,256 19,531

y = 2,4733x + 7,2715R² = 0,9993

0,000

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

0,0 2,0 4,0 6,0

t/V

(m

in/L

)

Tiempo (min)

Vmax

t/V (min/L)

Series2

Lineal (Series2)

Pendiente = 1/Vmax = 2,47 L-1 Ordenada = 1/Qi = 7,27 min L-1

Vmax= 1/Pendiente = 0,404 L Qi = 1/Ordenada = 0,138 L/min

Se uso filtro 47 mm diámetro. Área = 17,35cm2


Método Vmax

Si normalizo el Vmax y Qi por el área

V’max = Vmax/A y Qi’ = Qi /A

t

V’max A

t

V

1

Q’i A= +

t = tiempo de procesoV= volumen a filtrar (L)A = área filtrante (m2)V’max=volumen máximo filtrable a tiempo infinito (L/m2)Q’i = Flujo volumétrico inicial normalizado (L/m2 min)


Método Vmax

Reorganizando la ecuación anterior:

Esta es la ecuación que se utiliza para calcular el área filtrante.

1

V’max

A

V

1

Q’i t= +

t = tiempo de procesoV= volumen a filtrar (L)A = área filtrante (m2)V’max=volumen máximo filtrable a tiempo infinito (L/m2)Q’i = Flujo volumétrico inicial normalizado (L/m2 min)


Método Vmax

Calculo del Área filtrante:

1. Determine experimentalmente:

Vmax = 0,404L, V’max = 233L/m2

Qi = 0,138 L/min, Q’i = 79 L/min

2. Definir escala y tiempo de proceso

Volumen a filtrar (V) = 1000LTiempo de filtracion = 60 min

AREA CALCULADA = 4,5 m2

1

V’max

A V1

Q’i t= + V

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El Vmax también se puede utilizar para comparar performance de distintos filtros en una misma aplicación.

En este estudio se comparan tres filtros en la filtración de un mismo volumen de producto, en las mismas condiciones.


Otro ejemplo de comparación de performance de distintos filtros:


Limitaciones de Vmax:

• El proceso de filtración se debe ajustar al modelo de taponamiento progresivo.

• En algunos casos se ven desviaciones positivas o negativas del modelo. Para evitar subestimar el área de filtración se utilizan factores de seguridad:

Área = Área teórica x Factor de seguridad

Ejemplo:Área = 4,5 m2 x 1,25% = 5,3 m2

(Área calculada con un 25% de factor de seguridad)

Filtración Viral

•Un producto biotecnológico podría estar contaminado por virus adventicios (ambiente, materia prima, etc ) o endógenos (en la línea celular productora).

•Las autoridades regulatorias piden que cualquier producto que provenga de células (ej: mAbs) tenga durante su elaboración dos operaciones que reduzcan la posibilidad de que el producto final este contaminado con virus.

•Se utiliza procesos de filtración viral, inactivación por pH, procesos cromatograficos, etc.

•Cualquier paso deberá validarse haciendo un ensayo de desafío con virus. Luego se realiza el proceso y se evalúan cuantos log cae el recuento viral.

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Filtración Viral

Existen distintos tamaños de poros utilizados para la filtración viral:

50 nm20 nm (para retener parvovirus)

También se puede realizar en distintas modalidades:Filtración normal (es la masa utilizada)Filtración tangencial.

Filtración Viral

Las filtraciones virales son muy costosas (hay que optimizarlas!!):•Necesitan Área filtrante grandes para tiempos de procesos lógicos.•El costo por m2 es muy alto.

• Filtration Tangential

Filtración Tangencial(Tangential flow filtration, cross flow filtration)

• El flujo es paralelo a la superficie filtrante.

• El movimiento de la solución de alimentación a lo largo de la superficie de la membrana ayuda a remover la acumulación de material en la superficie.

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Filtracion Tangencial(Tangential flow filtration, cross flow filtration)

Existen distintas configuraciones de membranas:

Hollow Fiber

Spiral-wound

Flat Plate

Aplicaciones de TFF

•ClarificaciónEl producto pasa a través de la membrana y las partículas mas grandes quedan retenidas en el retenato.Ejemplo: clarificación de cosechas provenientes de un reactor.

• Concentración •El producto se retiene y el solvente pasa a través de la membrana.

•Diafiltración o cambio de bufferEl producto se retiene, el solvente pasa a través de la membrana y el nuevo solvente se agrega al producto

Filtración Tangencial(Tangential flow filtration, cross flow filtration)

Flujo de permeado, Flux(Permeate/Filtrate Flow)

Flujo alimentacion(cross flow)

Flujo de retenido(Retentate Flow)

Membrana

Presion de entrada(Feed pressure)

Presion de salida(Retentate Pressure)

Presion de Permeado(Permeate Pressure)

Permeado

Retenido

Presión transmembrana(TMP: Transmembrane Pressure )

Flujo de permeado(Permeate/Filtrate Flow)

25 psi 15 psi

Membrana

Presion de entrada(Feed pressure)

Presion de salida(Retentate Pressure)

Presion de Permeado(Permeate Pressure)

Permeado

Retenido

2 psi

TMP = (Pin + Pout) - Pperm

2

TMP = (25 + 15)/2 - 2 = 18 psi

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Variación de la presión a lo largo de la fibra en TFF

Flujo de permeado(FLUX)

Es el flujo al cual permea la solución que estoy filtrando.

Me da idea de la capacidad del filtro.

Se normaliza por la superficie del filtro.

Flux = Volumen/Area de la membrana/Tiempo)

Unidades = L / m2 / hr (LMH)

Otros parámetros importantes

Flujo de recirculación (Cross flow rate).

•Es el caudal al cual alimento del producto.

Rechazo ( rejection, R)•Mide la capacidad de la membrana de retener a un soluto.

RR= 1 - CC soluto en Permeado (Cp)

CC soluto en retenido (Cb)

Tambien se puede expresar como %R.

R = 0 para molécula NO retenida. Permea 100%

R = 1 para molécula retenida completamente. NO Permea.


•Factor de concentración (VCF, volume concentration factor).

•Es grado de concentración que sufre el volumen inicial durante el proceso:

Volumen inicial20L

Volumen inicial2L

VCF = 20/2 = 10

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Diavolumenes (DV o N):Es una medida de cuanto se diafiltro un material.

DV = Volumen de buffer de diafiltración/Volumen de material a diafiltrar

Volumen inicial10L

Volumen final10L

Volumen buffer diafiltración20L

DV = 20/10 = 2

Volumen inicial5L

Volumen final20L


DV = 15/5 = 3

Volumen inicial20L

Volumen inicial5L

FOULING (taponamiento)

•Se refiere a la disminución del flujo de permeado debida a la interacción (adsorción o deposito) entre el soluto, partículas y la membrana.

•Es irrebersible durante el proceso. No se puede restablecer el flujo de permeado original cambiando condiciones en proceso.

•Solo se puede revertir limiando la membrana (post proceso)

Clasificacion TFF(basada en el tamaño de los componentes que separa)

Esquema basico de TFF

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Teoría Filtración tangencial

• La fuerza que impulsa al permeado es la presión transmembrana (TMP)

La relación entre el flujo de permeado y el TMP esta dada por la ecuación de Hagen Poiseuille, para solventes como el agua.

TMP d2p e

32 x µp

Flujo de permeado =

dp: Diametro del poroe: porosidad de la membranax : largo del poroΜp: viscocidad del liquido permeado


La ecuación se cumple para solventes que no tienen solutos, dando una relación lineal del flujo de permeado con el TMP.

La ecuación no se cumple para fluidos que contienen componentes que son retenidos por la membrana.

La desviación se debe a la polarización de la concentración que se genera sobre la membrana por acumulación de solutos o partículas retenidas.

Aunque el crossflow barre la membrana, se genera sobre ella una capa donde se acumulan moléculas (concentrationpolarisation layer).

Ocurre normalmente en proceso.


La capa de polarizacion de concentracion produce la desviacion asintotica de la curva de Permeado vs TMP ya que genera una resistencia extra al permeado.

Ademas la alta concentracion de solutos sobre la membrana genera una presion osmotica contraria al TMP que tambien disminuye el permeado.

En base a lo dicho anteriormente se puede definir (modelo resistencias en serie):

TMP - π

RM + RC

Flujo de permeado =

π : Presión osmóticaRM : Resistencia intrínseca de la membranaRC : Resistencia debida a la polarización de concentración


El valor RM es constante en el proceso y depende de características de la membrana (tamaño de poro, densidad de poro, etc). Se puede calcular midiendo experimentalmente el flujo de permeado en función del TMP:

El valor RC depende de varios factores que afectan el espesor y la permeabilidad de la capa de polarización de concentración:

TMPVelocidad de recirculación (cross-flow)Viscosidad del fluidoTemperaturaConcentración de soluto.

TMP

Flujo permeado aguaRM =

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Teoria Filtracion tangencial

TMP - π

RM + RC

Flujo de permeado =

Resistencia al permeado

Resumiendo, la resistencia al permeado es funcion de:

Tamaño del poro.Cuanto menor es el poro, a igual TMP, menor el flujo de permeado

Grado de formación de la capa de gelCuanto mas importante sea la formación de la capa de gel, menor es el flujo de permeado

Fouling

El aumento en el crossflow como regla general reduce el espesor de la capa de gel incrementando el flux.

Factores importantes en TFF

Temperatura

• En el caso del agua, el flujo de permeado (Flux) aumente con el aumento de la temperatura.

• Para materiales biológicos es mas difícil de predecir el cambio en el Flux con la temperatura ya que el flujo de permeado también depende de la resistencia que ofrece la capa de gel y el grado de fouling en la membrana. Estos factores son característicos de cada material a filtrar.

• En general se ve que el flux aumenta con la temperatura.


TMP (Presión transmembrana)

• El flujo de permeado (Flux) aumente con el aumento de la TMP.

• Para el agua la relación es línea.

• En proceso se observa que a partir de una determinada presión se hace asintoticadebido a la compactación de la capa de gel.

• La TMP optima de proceso es la presión en la cual se produce la inflexión en la curva.

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Flujo de recirculación (Crossflow)

• El aumento del flujo de recirculación disminuye la capa de gel, disminuyendo la resistencia al flujo de permeado (aumenta Flux).


Concentración del material

• El flujo de permeado esta muy influencia por la concentración de los componentes.

• El flujo de permeado disminuye con el aumento de la concentración de los componentes.

Desarrollo de TFF

Define tus objetivos (hay que tener métodos analíticos para poder evaluar si se cumplen):

1. Concentración final del producto.

2. Grado de diafiltración. (%buffer original, mS/cm, etc).

3. Rendimientos

Desarrollo del proceso:1. Elección del tipo membrana (poro, lumen, etc) y superficie

(afectan tiempos de proceso)

2. Crossflow (define el equipamiento)

3. Determinación del TMP de trabajo (afecta los tiempos de proceso)

4. En diafiltración, esquema de diafiltración (repercute en consumo de buffers)

Elección del tipo de membrana

Tamaño de poro, en base a la aplicación:Si quiero que se retenga: 3-5 veces mas chico que el MW proteína:

Ejemplos: hGH MW 22kDa, si quiero concentrarla usare MMWC = 5kDaIB (tamaño 0,22-0,45um, si quiero retenerlos poro = 0,1um)

Lumen del canalTengo que elegir un lumen que sea lo suficientemente grande para evitar taponamientos de la fibra.Ejemplos:

hGH (proteína en solución) lumen = 0,5mmIB (tamaño 0,22-0,45um), lumen mas grande, aprox 1mm)

MaterialElegir un material adecuado para la aplicación:Ejemplos:

Para proteínas, utilizar membranas con bajo binding

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Selección de la membrana en TFF

• Impacto en la adsorción del producto a la membrana

Low Protein case = 10g/m2 , High proteina case = 500g/m2

La celulosa regenerada se utiliza cuando el proceso no es a pH extremos y cuando la carga es baja ( < 20g/m2 ).

Desarrollo de TFF

R: 1 – ( Cp / Cb )

• Impacto del R en la selección de la membrana

Reglas:

•Si quiero retener la proteína usar poro 3-5 veces mas chico que su MW.

•Si quiero permear la proteína usar poro 10 veces mas chico que su MW.

Elección del crossflow

El permeado aumenta con el crossflow.

Elegir un crossflow bajo implicara que se tenga que compensar aumentando el área del filtro para tener un tiempo de proceso adecuado.

La elección de un crossflow alto:•puede repercutir en la estabilidad del producto. A mayor crossflow, el producto pasa mas veces por la bomba, aumentando las chances de que se dañe.•Aumenta el volumen muerto del equipo, porque necesito tubuladuras mas grandes y bombas mas grandes.•Aumenta el costo del equipamiento.

Como lo defino?•Recomendaciones del proveedor: tanto los cassettes como las fibras huecas tienen recomendaciones de flujo para cada aplicación. •Limitaciones técnicas y/o económicas (volumen muerto/costos).

Modo de recirculación total

PERMEATE

RETENTATE

Se mantien la concentracion constante

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Determinación de la TMP de trabajo

Se realiza con una configuración de recirculación total.

Se mide el Flux a distintos TMP y se grafica Flux = f ( TMP ).

Se selecciona la TMP optima del proceso. Va a corresponder a la TMP del punto de inflexión.

Si trabajo a TMP menor, voy a tener un permeado suboptimo que va a terminar repercutiendo en una área mayor de filtro.

Si trabajo en la zona donde el permeado es independiente del TMP puedo tener mayor riesgo de fouling y perdida de proteína (aumenta mucho la concentración de la prot. sobre la membrana).

Flux vs TMP

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50

TMP psig

LM

H

Pin Pout TMP ∆∆∆∆P

10 0 5 10

20 10 15 10

30 20 25 10

Esquema de diafiltración

Diafiltración discontinua:

Volumen CC15L, 8 mg/mL

Volumen DIAF120L, 2 mg/mL

Volumen inicial20L, 2 mg/mL


Volumen buffer diafiltracion15L

Volumen DIAF220L, 2 mg/mL


Volumen buffer diafiltracion15L

Consumo de buffer = 30L (6DV)Concentración proteína vario entre 2 y 8 mg/mLdurante la diafiltración.Volumen permeado = 45LComposición final:

94% buffer diafiltración6% buffer original

Esquema de diafiltración

Diafiltración continua:


Volumen inicial20L, 2 mg/mL

Volumen final5L, 8 mg/mL


Consumo de buffer = 15L (3DV)Volumen permeado = 30LComposición final:

95% buffer diafiltración5% buffer original

Ejemplo escalado

Microfiltración cosecha de mAbs:

Volumen CC18L – 1g/L – 8g

Volumen inicial31,2L – 1g/L – 31,2g

Volumen final8L – 1,1g

Lavado con 16L de buffer

Cosecha23,2L – 1g/L – 23,2g

Lavado 16L – 6,9g

Rendimiento: Cosecha: 23,2g (74,3%)Lavado: 6,9g (22,1%)TOTAL: 30,1g (96,5%)

*Supongo R=0 para el monoclonal en microfiltración.

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Ejemplo escalado

Microfiltración cosecha de mAbs:

Importante

• Antes de un proceso:

– Test de integridad.

• Después del lavado:

– Medir NWP para comparar contra el NWP del cartucho sin uso. Si es < 80%, la limpieza no fue efectiva.

NWP, método para evaluar limpieza membrana

NWP: normal water permeability

• Es un procedimiento que se realiza para ver si se realizo bien la limpieza del filtro.

• Se debe realizar antes de usar el filtro.

• Luego de cada limpieza se determina el NWP. Se considera que la limpieza fue efectiva si el NWP calculado es mayor o igual al 80% del NWP inicial.

• Se mide el flux con agua a una dada TMP y se corrige por la temperatura.

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