02-transcripció a procariotes

Flux o transmissió de la informació genètica “Expressió gènica”

Trancripció Traducció

Replicació

Trancripció Traducció

Replicació

Tipus d’RNA Inici de la transcripció (I)

<4% mides molt variables

80% Estructural

U-RNA spliceosomes

Modificació rRNA tRNA metilació pseudouridinilació

Micro RNA i RNA d’interferència, interfereixen l’espressió de gens concrets.

Recordem: les diferències de la molècula de RNA amb la de DNA

2’-OH

L’uracil interacciona per ponts d’H amb l’adenina en la molècula de RNA.

Recordem que l’RNA pot adquirir diferents estructures secundàries

L’ RNA és de cadena senzilla i llavors adopta moltes estructures diferents d’aquest tipus. La mateixa molècula de RNA pot adoptar més d’una estructura tridimensional (amb funcions específiques). Adaptat de l’Alberts i col. “Biologia Molecular de la Célula” i

del Lehninger “Principles of Biochemistry”

Transcripció:

• És la síntesi de la molècula de RNA

catalitzada per la RNA polimerasa,

utilitzant una cadena de DNA com a

motlle, per donar lloc a un “producte

gènic”:

-RNA funcional: estructural o catalític

-RNA missatger que donarà lloc a una proteïna.

Proteïna

tRNA

DNA

Adaptat de l’Alberts i col. “Biologia Molecular de la Célula”

Reacció de la RNA polimerasa (1960)

Característiques de les RNA polimerases:

Necessiten un motlle de DNA. Els 4 ribonucleòtids i Mg2+

Polimeritza RNA en direcció 5’ a 3’, mitjançant la formació d’enllaços fosfodiéster. Llegeix la cadena motlle del DNA en direcció 3’ a 5’ (antiparal·lela i complementària a la nova cadena d’RNA).

No tenen activitat correctora

Alta processivitat

Caràcter asimètric

No necessiten encebador, s’uneixen a seqüències promotores.

Inici de la transcripció (I)

La transcripció produeix una sola cadena de RNA. Cadena Motlle i codificant

5’ AAACGCUAUAGCG 3’

Figura 6-13 Biología molecular de la célula, quinta edición (© Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

Es transcriu tot el genoma al mateix temps? Les dues cadenes poden codificar proteïnes o RNAs?

Organització de la informació codificant en un fragment del genoma d’adenovirus transcrit en les dues direccions.

Diferents gens, uns codificats en la “cadena de dalt” i altres per la cadena de baix . Les dues cadenes codifiquen missatges diferents.

5’

5’ 3’

3’

Cadena codificant 5’-3’

Cadena motlle 3’-5’

molècula de RNA 5’-3’del gen de dalt

molècula de RNA 5’-3’del gen de baix

5’ AAACGCUAUAGCG 3’

Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”

Adaptat de Luque, J., y Herráez, Á. Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética. Ed. Harcourt

Estructura d’un gen. La transcripció d’un gen s’inicia en un punt concret. Promotor lloc d’unió de la RNA polimerasa.

La seqüència de DNA correponent a un gen també ens diu en quin moment s’ha de fabricar el producte gènic, en quines cèl·lules i en quina quantitat.

Transcripció a procariotes

Estudis amb E.coli

Transcripció a procariotes: Estructura de la RNA polimerasa de E.coli

* transcriu tots els RNAs * holoenzim: Estructura de 500 kD amb sis subunitats de 5 tipus: (α2ββ’ω) σ.

a s’uneix a seqüències UP reguladores. b forma enllaços fosfodiester. b ‘ s’uneix al DNA. (ββ’ és el centre catalític) s responsable de l’inici de la transcripció.

“Core” o nucli de l’holoenzim (α2ββ’ω)

Subunitat σ (hi ha diferents subunitats σ)

La síntesi de RNA comença en els promotors: seqüències de reconeixement per a l’iniciació de la transcripció.

Iniciació de la transcripció: existeixen seqüències específiques de reconeixement al DNA: promotors

Seqüències conservades en el promotor procariota reconegut per la subunitat σ 70

T T G A C A

Les mutacions en els promotors poden variar l’eficiència de la transcripció Les mutacions a la regió -35 afecten la unió de la RNA polimerasa Les mutacions a la regió -10 afecten la separació de les cadenes

Genetistes, operó lactosa, 1964.

DNA motlle

Regió -35 Seqüència Inici RNA Pribnow

TTGACA TATAAT

+1 -10 -35

Seqüències consens del promotor bàsic procariota.

Aquestes dues caixes són elements clau perquè s’hi uneixi la polimerasa. Però hi ha altres elements reguladors. Promotors forts i Promotors febles segons les seqüències. És tant important la conservació de la seqüència com la de la posició relativa dels diferents elements.

La interacció de l’RNA polimerasa amb el DNA: tècnica de footprinting “empremta genètica”

La interacció de l’RNA polimerasa amb el DNA es pot visualitzar mitjançant la tècnica de footprinting. En la que es pot veure que la regió protegida es de uns 60-80 bp i inclou ambdues regions de -10 i -35.

Adaptat del Stryer “Bioquímica” i del Lehninger “Principles of Biochemistry”

Indiqueu si les següents afirmacions són vertaderes o falses: • Les RNA polimerases poden començar la còpia d’àcids nucleics sense necessitat

d’un encebador. • La RNA polimerasa en fase d’elongació presenta una síntesi tan processiva que,

una vegada iniciada la síntesi no es desenganxa fins a trobar els senyals d’acabament.

• S’entén per transcripció únicament la síntesi d’un únic tipus de RNA, la síntesi de RNAm.

• A procariotes l’inici de la transcripció implica la unió prèvia de varies proteïnes a seqüències consens dels promotors perquè pugui unir-se la RNA polimerasa.

• Quins són els dos motius presents en els promotors típics bacterians que els defineixen i que són necessaris pel reconeixement de l’holoenzim RNA polimerasa σ70?

• La subunitat de la RNA polimerasa d’ E. coli que reconeix als llocs promotors s’anomena: β, α, β‘, γ, s70.

QÜESTIONS Indiqueu si les següents afirmacions són vertaderes (V) o falses (F): - El nucli (core) de la RNA polimerasa bacteriana no es capaç de

distingir entre els promotors i altres seqüències del DNA. - El factor s confereix a l’holoenzim bacterià especificitat pel

promotor. - El reconeixement del promotor bacterià no depèn de seqüències

consens. - En bacteris es dóna amb molta freqüència l’splicing alternatiu.

La tècnica de “footprinting” permet determinar: a. L’homologia entre varies seqüències de DNA. b. Com unes proteïnes interaccionen amb les altres quan s’uneixen al

DNA. c. A on s’uneixen les proteïnes al DNA.

Etapes de la transcripció

• inici: requereix seqüències promotores.

• elongació: Allargament de la cadena de RNA per la RNA polimerasa.

• terminació: requereix de senyals de parada o de factors proteics.

Tant a procariotes com a eucariotes la transcripció es dóna en tres etapes:


Etapes en la

transcripció de l’RNA

polimerasa

Etapa de l’inici de la transcipció (unió)

Formació del complex tancat: unió de l’RNA polimerasa

de σ i unió reconeixement

El DNA està encara com a doble hèlix


Etapa d’inici de la transcripció

Complex Obert: el DNA té un petit segment desenrotllat de 17 pb.

La caixa Pribnow rica en A i T és més fàcil de fondre (obrir).

Complex ternari: DNA pol DNA-RNA 8pb.

Les subunitats β i σ intervenen en la formació del complex obert.


Transcripció per l’RNA polimerasa (elongació)

Bombolla de transcripció.

Híbrid DNA-RNA de 8 nt.

Síntesi RNA 5’ a 3’.

Velocitat 40-50 nt/s.

RNA pol no es desenganxa (processiu).


Superenrotllament del DNA provocat per la transcripció

L’elongació produeix una tensió en el DNA i provoca:

-superenrotllament positiu pel davant de la bombolla de transcripció.

-superenrotllament negatiu pel darrera la bombolla.

Més

enrotllat

Menys

enrotllat


Terminació de la transcripció independent de rho

“Hairpin” (ganxo) de terminació Depèn només de la seqüència

Es forma aquesta estructura secundària “hairpin” molt a prop de la bombolla, molt estable pel contingut de CG.

2 seqüències palindròmiques riques en CG, i a continuació es troben vàries T.

Figura de Garret & Grisham: Biochemistry, 2a Fig 31.7

Model de Terminació de la transcripció independent del factor Rho

Crea tensió i impediment estèric

Aparellament A=U feble

•Disminueix la velocitat de la polimerasa i la transcripció al trobar les CG.

•Amb l’estructura secundària del RNA i a més les unions febles al motlle U=A, tot plegat fa que la polimerasa es pari i el RNA es desenganxi sortint del complex.


Terminació de la transcripció dependent del factor Rho: Depèn de la seqüència del DNA i de la proteïna Rho.

• És una helicasa que té 6 subunitats

• s’enganxa a l’RNA.

• es desplaça per l’RNA de 5’a 3’.

• trenca la hibridació RNA-DNA.

• i desfà el complex.

Regió seqüència rica en GC

Disminueix velocitat polimerasa

Figura 28-12 Stryer 5a Ed

Rho-Dependent Transcription Termination (depends on a protein AND a DNA sequence)

G/C -rich site

RNAP slows down

Rho helicase

catches up

Elongating complex is disrupted

Indiqueu si les següents afirmacions són vertaderes o falses: • A procariotes l’holoenzim de la RNA polimerasa conservarà totes

les subunitats al llarg de la transcripció.

• Els exons constitueixen les seqüències codificants del genoma del bacteri.

• En el cas de la síntesi dels mRNAs el promotor del gen no es transcrit.

• Els gens tenen seqüències que indiquen el seu inici, el seu acabament i altres que regulen la seva expressió.

• La RNA polimerasa bacteriana acaba la transcripció quan troba una seqüència rica en CG seguida d’una altra de vàries T.

QÜESTIONS Les funcions de la RNA polimerasa inclouen: a. Buscar els llocs del promotor. b. Desenrotllar fragments curts del DNA. c. Detectar els senyals de terminació. d. a i c. e. a, b, i c. L’estructura del DNA ha d’estar ________________ perquè tingui lloc la

transcripció. a. Complex en el promotor tancat. b. Complex en el promotor obert.

Quines de les següents afirmacions caracteritzen millor la terminació de la

transcripció? a. Les seqüències senyal de terminació de la transcripció es troben a dins

del transcrit. b. Les seqüències senyal es troben en el DNA aproximadament a 30 pb

més avall del lloc de terminació. c. La transcripció acaba quan la polimerasa arriba a un codó d’stop. d. La transcripció acaba quan la polimerasa arriba al promotor del gen

adjacent. e. La transcripció acaba quan la polimerasa arriba al codó d’inici del gen

següent.

On té lloc la regulació de l’expressió gènica en procariotes? Punts de control.

Expessió gènica constitutiva. És la que es dona en tots aquells gens que es necessiten contínuament. Factor Sigma.

Expressió gènica regulada, que depèn de la influencia de proteïnes reguladores: inducció i repressió

GENDNA

TranscripcióNucleòtids

Trànscrit primari

RNAm madur

Traducció

Modificaciópostraducció

Direccionament de laproteïna i transport

Degradacióproteica

AminoàcidsProteïna(inactiva)

Proteïnamodificada(activa)

GENDNA

TranscripcióNucleòtids

Trànscrit primari

RNAm madur

Traducció

Modificaciópostraducció

Direccionament de laproteïna i transport

Degradacióproteica

AminoàcidsProteïna(inactiva)

Proteïnamodificada(activa)

Regulació de l’inici de la transcripció a bacteris


Diferents subunitats sigma, que reconeixen seqüències diferents, són essencials per l’iniciació de la transcripció

σ 70 reconeix el promotor estàndard “housekeeping” per les funcions bàsiques de la cèl·lula.

Altres subunitats sigma alternatives controlen operons específics que s’activen en determinades condicions d’estrès o de creixement:

σ 32 reconeix el promotor de xoc tèrmic.

σ 54 reconeix el promotor de proteïnes que usen fonts alternatives de nitrogen.

Variacions de les seqüències promotores respecte de la consens i la utilització de diferents subunitats σ ja és una forma de regulació gènica específica.

- Regulació a través de proteïnes reguladores

model regulació positiu

model regulació negatiu

- Concepte d’Operó

- Operons lac i triptofen : models de regulació

Expressió gènica regulada en E. coli

Patrons de regulació de l’inici de transcripció a procariotes. Regulació positiva.

Una molècula senyal (efector) causa dissociació de la proteïna activadora de l’DNA, inhibint la transcripció.

L’activador facilita la transcripció unint-se a la seqüència reguladora.

L’activador s’uneix a l’DNA si esta associat a una molècula senyal (efector) i llavors activa la transcripció.

molècula senyal

Quan disminueix la conc. De la molècula senyal causa dissociació de la proteïna activadora de l’DNA. Ex. Proteïna CAP operó lactosa.


Patrons de regulació de l’inici de transcripció a

procariotes. Regulació negativa per proteïnes repressores

El repressor s’uneix al DNA només si esta associat a una molècula senyal (efector) i llavors inhibeix la transcripció.

El repressor per si sol s’uneix al DNA (seqüència de l’ “operador”) i inhibeix la transcripció.

Una molècula senyal (efector) causa la dissociació de la proteïna repressora del DNA i permet la transcripció. Ex. Proteïna repressora operó Lactosa.

molècula senyal

Quan disminueix la conc. De la molècula senyal causa dissociació de la proteïna repressora de l’DNA. Ex. Proteïna repressora operó triptofan.


Lloc d’unió del repressor

(operador)

Lloc d’unió de l’activador

Seqüències reguladores Gens transcrits com una unitat

Operó procariota: centre operador, gens reguladors i gens estructurals

• La majoria de gens procariotes estan agrupats i es regulen en “operons”. • Un operó està constituït per un grup de gens estructutrals, un promotor i seqüències addicionals que funcionen conjuntament en la regulació. • Generalment el transcrit d’un operó és un RNAm policistrònic.

RNAm policistrònic.


1960 François Jacob Jaques Monot

L’operó Lac conté: - 3 gens estructurals: Galactosidasa Permeasa Transacetilasa -un promotor per aquests gens. -sequències reguladores (operador i CAP site) -una seqüència que codifica per un repressor “i” i el seu promotor que controla la seva l’expressió.

Gens estructurals de l’operó lac

La activació de l’Operó lac permet la utilització de la lactosa com a única font de carboni


esquerre i......

Exemple de regulació en procariotes Operó lac

El objectiu de la regulació és modificar la transcripció de l’operó lac, amb dues molècules senyal que són clau: alol·lactosa i AMPc.

Control negatiu L’element de regulació és una proteïna repressora unida al DNA que quant s’uneix a la alol.lactosa, perd afinitat per l’DNA i permet la transcripció. Control positiu L’element de regulació és un activador, CRP o proteïna receptora d’AMPc (CAP, catabolit gene activator) que quant s’uneix a l’AMPc activa la transcripció.

McKee 2003, 1ª ed.

L’operó lac és regulat negativament

mRNA policistrònic

b-Galactosidasa

Permeasa

Transacetilasa

El repressor unit a l’operador no hi ha transcripció

La regulació de l’Operó lac té lloc a nivell de l’operador.

Promotor (unió de la RNA polimerasa) Inici de transcripció

Operador (unió del repressor lac)

Seqüència del promotor Lac

DNA

Seqüència simètrica Repressor 2 dímers



Dos dímers del repressor lac s’uneixen a l’operador

principal i a un dels dos llocs secundaris, formant un llaç

Creixement de bacteris en presència de glucosa i lactosa

Activitat β-

galactosidasa

Fenomen de repressió catabòlica

Això és deu a que hi un segon control a través de la proteïna reguladora CAP (catabolite activator protein o proteïna receptora d’AMPc).

Jaques Monod

1941

Regulació positiva de l’operó lac a través de la proteïna CRP o CAP (cAMP receptor protein)

el lloc CRP-AMPc

és palindròmic

Unió a l’RNA polimerasa Domini d’activació

cAMP

DNA unit a l’homodímer CRP (cAMP receptor protein)

Glucosa Baixa AMPc alt CRP unit AMPc Unió a DNA Activació transcripció

Motiu hèlix-turn-hèlix

Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”, de l’Alberts “Biologia Molecular de la Célula” i del Stryer i col.“Bioquímica”

Acció combinada de glucosa i lactosa en l’operó lac

Glucosa AMPc

Glucosa AMPc

Raonament: Hi ha transcripció quan hi ha poca glucosa Primer s’aprofita la glucosa i després la lactosa

Paper del cAMP

El repressor sempre esta lligat. Perquè hi hagi activació és necessari que hi hagi lactosa i a més la unió de CRP


Model “dual” de regulació:

L’operó es transcriu perquè CAP està unida i no hi ha repressor.

L’operó no es transcriu perquè CAP no està unida, encara que el repressor no està unit.

L’operó no es transcriu perquè el repressor està unit i CAP no està unida.

L’operó no es transcriu perquè està unit el repressor, a pesar de que CAP està també unida.


http://highered.mcgraw-hill.com/sites/dl/free/0072437316/120080/bio27.swf






Exemple de control negatiu:

operó del triptòfan

Nivell baix triptòfan Nivell alt triptòfan

Enzims per la biosíntesi de triptòfan.


La unió del triptòfan augmenta la distància entre les dues hèlix de reconeixement, canvi de conformació i unió a l’DNA.


Indiqueu si les següents afirmacions són vertaderes o falses: • Els gens procariotes poden estar organizats en forma d’operons, no tenen

introns ni es poliadenilen i solen ser policistrònics. • Un operó és un conjunt de senyals reguladores que controlen la

transcripció d’un conjunt de gens estructurals adjacents, tots sota el control d’un únic promotor.

• La proteïna CAP (catabolite activator protein) activa l’expressió de l’operó Lac quan s’uneix a l’AMPc.

• Els promotors són seqüències que regulen el lloc en el que s’inicia la transcripció d’un gen i la freqüència de la seva expressió bassal.

• Quan hi ha nivells elevats de triptòfan, el repressor del triptòfan està unit a l’operador i bloqueja l’accés de la RNA polimerasa al promotor. És tracta d’un exemple de regulació negativa.

02-transcripció a procariotes

Documents