02-esterilización (anexo)

Microbiología General Facultad de Ciencias Exactas

ESTERILIZACION

El término esterilización puede definirse como el conjunto de operaciones destinadas a eliminar o matar todos los microorganismos presentes en un objeto o sustancia. Como consecuencia de ésta definición un objeto o sustancia estará estéril cuando se demuestre ausencia absoluta de toda forma viable de vida, no existiendo grados de esterilidad.Para comprender el fundamento de la esterilización por agentes letales es necesario conocer la cinética de muerte de una población microbiana. El único criterio válido de muerte en el caso de los microorganismos es la pérdida irreversible de su capacidad de reproducción.Cuando una población microbiana se somete a un proceso de esterilización, el número de sobrevivientes (N) disminuye exponencialmente con el tiempo de exposición hasta que no puedan detectarse más organismos viables (Fig. 1). Si se representa gráficamente el logaritmo decimal o natural de N en función del tiempo, se observará un comportamiento lineal, donde la pendiente de la recta obtenida corresponde a la constante de inactivación del proceso (k), que es una medida de la velocidad de muerte de los microorganismos viables (Fig. 2). La función que representa el comportamiento descripto corresponde a una cinética de primer orden, donde la velocidad de destrucción de células es directamente proporcional al número de sobrevivientes.

Esto puede expresarse mediante la siguiente ecuación:

dN=-kN (1) dt

donde N: es el número de microorganismos viables en el volumen considerado

t: es el tiempo de exposición al agente letalk: constante de velocidad de muerte celular

dN/dt: velocidad de muerte celular

Si se considera que k no dependen del tiempo, la integración de esta ecuación (1) permite calcular el tiempo necesario para reducir la población a un determinado valor de N como:

t= 2,303 log N0 (2) k N

donde N0: es el número de microorganismos viables inicialesN: es el número de microorganismos viables luego del tiempo de exposición t.

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De las gráficas puede verse que no es posible, teóricamente, alcanzar el valor N=0. Cuando el valor es inferior a la unidad, indica la probabilidad de encontrar un microorganismo viable.

De lo expuesto se desprende que cuanto mayor sea N0 y menor la velocidad de muerte, mayor será el tiempo que el material deberá ser expuesto al agente esterilizante, para alcanzar la probabilidad de contaminación que se considere adecuada. Esta tendrá un margen de variación según la futura utilización del material a esterilizar, el método utilizado, condiciones de esterilización y otras variables del sistema a considerar. Hemos visto hasta aquí que la muerte de los microorganismos responde teóricamente a una cinética de primer orden. Sin embargo, existen desviaciones al modelo por diferentes causas. A continuación se muestran curvas que presentan desviaciones del modelo teórico. En estos ejemplos el

agente esterilizante es calor húmedo a temperatura constante.En la figura 3 se representa el comportamiento observado en un cultivo de microorganismos esporulados. En los primeros minutos del proceso son más los esporos que se activan que aquellos que mueren por acción del calor húmedo.

La figura 4 muestra un caso similar al anterior donde la velocidad de activación de los esporos es aproximadamente igual a la velocidad de muerte.

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FIGURA 3FIGURA 4


Finalmente, se observa en la curva de la figura 5, el comportamiento de un cultivo de dos poblaciones microbianas con diferente sensibilidad al agente esterilizante.

-Parámetros de referencia en las curvas de muerte

A partir de las gráficas de las curvas de muerte se pueden definir una serie de parámetros útiles para caracterizar y comparar procesos de esterilización. En la figura 6a y 6b se indican los valores correspondientes al tiempo de reducción decimal D (3) y a Z (4). D se define como el tiempo en minutos necesario para reducir en un 90% el número total de microorganismos viables. Z es el incremento de temperatura requerido para reducir en un 90% el valor de D, e indica la respuesta de un organismo al cambio en el valor del factor de muerte.

de la ecuación (2) se obtiene D= 2,303 cuando N es el 10% de N0

k

De la gráfica de log D en función de la temperatura se deduce (fig. 6b)

1= log D2-log D1

Z T1-T2

Figura 6a

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FIGURA 5


Figura 6b

Conclusiones

Basándose en las consideraciones anteriores teóricamente no es posible alcanzar un valor de N=0, definiremos en forma práctica a la esterilización, como un tratamiento que tiene por finalidad lograr que la probabilidad de encontrar tan sólo un microorganismo viable en el material tratado sea infinitamente pequeña. Esta definición solo tiene validez cuando se trata de procesos que utilizan agentes letales para lograr la esterilización.

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Métodos de esterilización

Los métodos convencionalmente usados se pueden clasificar de acuerdo al agente y/o proceso esterilizante en:

- Calor húmedo- Calor seco- Químicos- Radiaciones- Filtración

Calor Húmedo

El calor húmedo es el método de elección para la esterilización de materiales capaces de resistir altas temperaturas. El proceso es rápido y todos los microorganismos resultan sensibles.Los mecanismos de esterilización por calor húmedo se basan en la desnaturalización de proteínas, aunque es posible que también tenga alguna importancia la fusión de los lípidos de la membrana. Las temperaturas a las que se llevan a cabo éstos procesos corresponden a las que desnaturalizan la mayoría de las proteínas.La esterilización por calor húmedo se lleva a cabo en equipos denominados autoclaves. La operación puede realizarse a presión atmosférica (100°C), vapor fluente, o a presiones superiores a la atmosférica, lográndose temperaturas mas elevadas. En la siguiente tabla se muestran algunas relaciones entre temperaturas

Temperatura (°C) Presión (atm) 100 1 114 0,75 121 1 135 2

Vapor saturado a presión superior a la normal

Bajo estas condiciones se logran temperaturas superiores al punto de ebullición del agua. Generalmente se emplea una presión de vapor de una atmósfera por encima de la presión normal, lo que corresponden a una temperatura de 121°C. El poder de penetración del vapor a esta temperatura es muy alto, lo suficiente como para destruir en 15 a 20 minutos, dependiendo del volumen del material a esterilizar, esporas que sobrevivirían a la ebullición durante horas. Por éste método se pueden esterilizar soluciones, medios de cultivo, material de vidrio, ropa, en general materiales que soporten la temperatura de esterilización.Existen varios tipos de autoclaves siendo el más comúnmente usado el de Chamberland. El equipo consiste en una caldera metálica (en general de cobre) rodeada por una camisa externa también metálica de forma cilíndrica, en cuya parte inferior, y por debajo de la caldera, se encuentra la fuente de calor.La caldera lleva en su interior un doble fondo desmontable y perforado sobre el cual se coloca el material a esterilizar. La parte superior cierra con una tapa de bronce que ajusta perfectamente mediante una junta

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de goma de siliconas y una serie de tornillos de bronce. La tapa presenta tres elementos que comunican con el interior de la caldera: el manómetro, que generalmente indica presión sobre la atmosférica, la válvula de seguridad, y la llave de salida de vapor o espita.

Instrucciones para su uso.

Cuando el autoclave se usa con vapor saturado a presión superior a la normal se deben seguir los siguientes pasos:

1. Colocar agua en la caldera procurando que su nivel no alcance a los objetos que se colocarán en su interior. Al material a esterilizar sólo le debe llegar el vapor que es el agente esterilizante.

2. Cargar el material a esterilizar debidamente acondicionado.3. Cerrar el autoclave ajustando los tornillos de su tapa en posición cruzada, a fin de asegurar un

cierre parejo y hermético. De ésta manera se prolonga la vida útil de la junta de siliconas, cuyo espesor debe ser homogéneo en todo el recorrido.

4. Abrir la salida de vapor y encender la fuente de calor.5. Asegurarse el correcto estado de la válvula de seguridad.6. La salida de vapor debe estar abierta para desalojar el aire interior, hasta que salga un chorro

continúo y abundante de vapor. La temperatura de trabajo, 121°C se alcanzará a la presión de una atmósfera sobre la normal solo si dentro del autoclave existe vapor en equilibrio con el agua, por lo cual es necesario asegurar la eliminación de aire del interior de la caldera. Si no se logra la adecuada eliminación del aire, la presencia de aire mezclado con vapor de agua resultara en una temperatura inferior a 121°C. De lo dicho se deduce que el manómetro

podrá marcar una atmósfera de sobrepresión, pero si no se ha efectuado una correcta eliminación de aire la temperatura será inferior a la esperada.

7. Purgar el aparato: se cierra y se abre tres veces la llave de salida de vapor, para eliminar los restos de aire.

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8. Cerrar. Calentar hasta que el manómetro indique la presión deseada. Regular la fuente de calor para mantener la presión constante. A partir de ese momento comenzar a contar el tiempo de esterilización.

El tiempo de exposición varía con el volumen de los líquidos contenidos en distintos recipientes:

RECIPIENTE VOLUMEN (ml)

TIEMPO DE EXPOSICIÓN (min)

vaso de precipitado 20 12-14 erlenmeyer 50 12-14 erlenmeyer 200 12-15 erlenmeyer 1000 20-25 erlenmeyer 2000 30-35

Los tiempos son válidos para un tratamiento a 121C

Una vez transcurrido el tiempo de tratamiento, apagar la fuente de calor y esperar que el manómetro marque cero. Recién en ese momento se puede abrir la llave de salida de vapor y luego la tapa del autoclave para retirar el material.

Vapor fluente o vapor a presión normal

El autoclave puede utilizarse empleando vapor saturado a 100 C (presión atmosférica). En este caso se trabaja con la llave de salida de vapor abierta. Cuando sale un chorro de vapor continuo y abundante, se purga el aparato y se deja abierta la llave. A partir de ese momento se cuenta el tiempo de exposición.Este proceso conocido como tyndalización utiliza la acción intermitente del vapor o la esterilización fraccionada. Se utiliza para la esterilización de materiales que no soportan temperaturas superiores a 100C. El proceso consiste en un calentamiento a 100C durante 30 minutos en el que mueren las bacterias en estado vegetativo. Luego se deja a temperatura ambiente durante una noche y se repite la operación, se deja nuevamente a temperatura ambiente y se procede aun tercer y último calentamiento.El método se basa en que en el primer calentamiento se logra destruir las formas vegetativas y se estimula la sensibilización de las formas esporuladas por acción de la temperatura y el medio líquido. En los posteriores calentamientos las formas esporuladas , ahora sensibilizadas, serán destruidas.Este método puede utilizarse para la esterilización de leche, gelatina nutritiva, solución de azúcares con concentraciones superiores al 10 %, etc.

Calor Seco

El calor seco a temperaturas por encima de 140ºC mata a las esporas bacterianas probablemente por oxidación destructiva. Este proceso es de menor eficiencia de muerte que la coagulación e hidrólisis de proteínas y por lo tanto requiere de temperaturas más elevadas y tiempos de exposición más prolongados que la esterilización por calor húmedo. Este procedimiento deteriora más los materiales como la goma, los tejidos y el papel, por lo que se lo usa, en general, para la esterilización de cajas de Petri, jeringas de

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vidrio, materiales hidrófobos anhidros como aceites y polvos, material de vidrio en general y otros materiales termorresistentes.

Fuego directo o flameadoConsiste en exponer a la llama del mechero Bunsen el objeto a esterilizar. Se emplea para ansas, pinzas, bocas de tubos de ensayo, puntas de pipetas, etc.

Aire calientePara esterilizar por medio de aire caliente es necesario colocar los objetos en estufas u hornos de esterilización eléctricos o a gas. A fin de lograr una llegada homogénea del calor a los elementos a esterilizar es necesario que el material sea distribuido espaciadamente y que las bandejas de la estufa sean perforadas. Es deseable que exista circulación de aire forzado. El proceso debe realizarse a un a temperatura de 180º C durante 90 minutos.

Métodos Químicos

Se recurre a agentes químicos cuando es necesario esterilizar materiales que no soportan altas temperaturas. El requisito fundamental para que un agente químico sea empleado como esterilizante es que además de ser letal para los microorganismos, sea volátil y fácilmente eliminable luego de la esterilización, que no reaccione con el material tratado ni deje residuos tóxicos.

Esterilización con Óxido de etileno

Si bien existe una amplia gama de sustancias gaseosas con propiedades germicidas, solamente el óxido de etileno (OET), es de amplio uso en esterilización en el área médica, farmacéutica e industrial. Se utiliza OET para esterilizar equipamiento médico quirúrgico tal como válvulas, prótesis, equipos de anestesia, tubos endotraqueales, etc.; material descartable de enfermería como jeringas, apósitos, tampones, sondas; productos farmacéuticos y cosméticos (polvos); productos alimenticios (alimentos desecados, especies, aditivos); elementos aeroespaciales.Algunas propiedades del óxido de etileno son: es soluble en agua en todas las proporciones, tiene bajo punto de ebullición, posee alto poder de penetración, por hidrólisis produce etilenglicol que tiene bajo poder germicida, razón por la cual la esterilización con OET sólo es aplicable a materiales sólidos.Puede actuar como vesicante por contacto con la piel, es irritante para los ojos y membranas mucosas. Hay evidencias de su acción mutagénica y carcinogénica sobre bacterias, semillas, Drosophila y determinadas líneas celulares.En presencia de aire u oxígeno da lugar a mezclas explosivas por ello se lo emplea en mezclas con freones o CO2.El OET resulta letal para todas las bacterias inclusive para esporos.Su acción letal sobre los microorganismos se ha explicado por reacción de alquilación con los principales componentes de la materia viva, particularmente proteínas y ácidos nucleicos, atacando los grupos sulfhidrilo, hidroxilo, aminas y carboxilos de los centros activos esenciales.

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En la esterilización con OET la eficacia del ciclo está determinada por parámetros previamente calculados para cada carga. Estos parámetros son: concentración del gas, humedad relativa, temperatura y tiempo de exposición. El rango crítico es humedad relativa es de 33% a 60% y debe ser mantenido durante toda la operación. Como el OET posee un coeficiente de temperatura elevado debe utilizarse la mayor temperatura posible (40º C a 50º C) para reducir el tiempo de exposición requerido, dependiendo de la naturaleza de los materiales a esterilizar. Para una concentración de OET de 500mg/l, a una temperatura de 50º C y una humedad relativa del 60 % el tiempo de exposición requerido es de 2 horas. Sin embargo, debido a la incertidumbre acerca de la eficiencia del proceso, en las condiciones mencionadas suelen emplearse tiempos de exposición que van de 3 a 4 horas para lograr un margen de seguridad más amplio.En general y dependiendo de las condiciones de concentración del OET, temperatura y humedad relativa, los tiempos de esterilización pueden variar entre 3 y 36 horas.Debido a que el OET puede ser absorbido por muchas sustancias como gomas, plásticos y fibras debe ser removido de los materiales esterilizados. La desgasificación puede realizarse dejando el material en depósitos o bien en estufas de desgasificación que funcionan con circulación de aire forzado. El tiempo de desgasificación depende de la capacidad de absorción del material esterilizado y nunca es inferior a 24 horas.Este método de esterilización resulta inadecuado par alimentos con alto contenido de proteínas y vitaminas, o compuestos con grupos sulfhidrilos.Dado que es altamente penetrante puede emplearse para la esterilización de artículos en paquetes sellados.

Descripción del equipo

Se utilizan autoclaves diseñados especialmente para trabajar con este gas. Hay equipos que funcionan con una única cámara, otros con dos: una destinada al proceso de esterilización y otra al de desgasificación. Poseen sistemas de control de temperatura, humedad, presión y tiempo. Pueden ser totalmente automáticos o semiautomáticos. Se trabaja siempre con gas licuado que pasa a la forma gaseosa en la etapa de inyección a la cámara. De acuerdo a la capacidad y diseño del equipo el OET licuado se dispone en ampollas de vidrio, cápsulas de aluminio descartables con sistema en aerosol o cilindros de metal.Los sistemas deben permitir el procesamiento de los distintos materiales en sus envases herméticos de protección, logrando con la mayor seguridad posible, ciclos rápidos y confiables. El diseño debe ser tal que se puedan operar en áreas normales de esterilización con energía eléctrica y sin suministro de componentes especiales. El equipo consiste en una cámara consrtruida en acero inoxidable con una puerta de cierre hermético. La cámara está calefaccionada por un sistema de resistencias eléctricas termostáticamente controladas. El interior del recinto posee las siguientes conexiones: 1 a un sistema de vacío, 2 a un sistema inyector de humedad, 3 a un sistema inyector de gas, 4 a una entrada de aire filtrado.Ciclo de operaciónSe carga el autoclave y se selecciona la temperatura. Se hace vacío hasta 0,1 a 0,5 atm.Se humidifica. Se inyecta el OET y se realiza la esterilización. Se evacúa el gas por medio del sistema de vacío, haciendo burbujear el gas en agua.Se inyecta el aire filtrado hasta igualar la presión atmosférica. Las operaciones 5 y 6 pueden repetirse.

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Radiaciones

Los tipos de radiación disponibles para esterilización son rayos , rayos ß, protones y electrones. Ninguno de los mencionados anteriormente tiene suficiente poder de penetración como para resultar de utilidad. Los neutrones rápidos pueden ser empleados en la práctica, con varias limitaciones. El tipo de radiación electromagnética más ampliamente empleado tiene muy corta longitud de onda, se denominan radiaciones ionizantes y entre ellas se encuentran los rayos X y los rayos γ. Otro tipo de radiación usada es la ultravioleta (UV) que se clasifica como no ionizante.

Radiación UV La muerte de las bacterias comienza a apreciarse a 330 nm y aumenta rápidamente al disminuir la longitud de onda, observándose la acción letal más efectiva a 260 nm, que corresponde al máximo de absorción de los ácidos nucleicos. El efecto principal se debe a la formación de dímeros de pirimidinas en una de las cadenas del DNA lo que distorsiona la molécula e impide su replicación normal.Los factores que influyen en la efectividad de este proceso de esterilización son: 1.Cuanto más prolongado sea el tiempo de exposición mayor efectividad del tratamiento,2. La intensidad depende de la potencia de la lámpara, distancia a la que se encuentra del objeto, clase y cantidad de material que interfiere el paso de los rayos. La presencia de polvo sobre la lámpara reduce su efectividad al igual que un exceso de humedad ambiente (más del 80 %).3. Poseen bajo poder de penetración, no atraviesan el vidrio ni objetos opacos. Su utilización queda limitada a la esterilización de aire, agua en delgadas capas y superficies.Las células secas son más resistentes a este tipo de radiación que las húmedas y las pigmentadas más resistentes que las no pigmentadas.La aplicación de las radiaciones UV queda circunscripta a reducir la población microbiana del aire y superficie de quirófanos, cubículos de siembra en laboratorios, recintos de envasado en la industria farmacéutica y alimenticia.

Radiaciones ionizantes La radiación ionizante no mata por afectar directamente a los componentes de la célula, sino que lo hace indirectamente al inducir la formación de radicales libres en el medio. Estos reaccionan con macromoléculas fundamentales de la célula y las inactivan. Si bien actúan sobre todos los componentes celulares, la muerte se produce por afectar especialmente al DNA originando un daño irreversible.La radiación ionizante presenta la ventaja de poseer una mayor capacidad de penetración (los rayos penetran capas de hasta 60 cm de agua), pero requieren instalaciones costosas y rigurosas medidas de seguridad para el operador.Las formas esporuladas son extraordinariamente resistentes a este tipo de radiaciones, probablemente por su bajo contenido de agua.

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Las radiaciones ionizantes se utilizan en la esterilización de productos farmacéuticos, artículos médicos y odontológicos descartables como jeringas plásticas, catéteres, guantes, bobinas de celofán para hemodiálisis y en la preservación de alimentos.

Filtración

El proceso de filtración difiere de otros métodos de esterilización en que sólo puede aplicarse a fluídos (líquidos y gases) y los contaminantes sólo son removidos, no destruidos. El método es rápido, puede llevarse a cabo a cualquier temperatura y es el método de elección para soluciones que contienen componentes termolábiles.Los microorganismos en suspensión se comportan como partículas cargadas y pueden ser removidas como tales. Los mecanismos de retención de tales partículas en el lecho del filtro comprenden tamización, adsorción, efectos de tensión superficial en las películas capilares retenidas y atrapamiento en los pliegues de los canales del filtro. Los dos primeros son de mayor importancia en la filtración de líquidos; y el primero y el último en la filtración de gases. Solamente la tamización, donde la partícula es de mayor tamaño que el poro, puede considerarse absoluto. Los otros procesos involucran un cierto grado de probabilidad de retención, lo cual depende de una variedad de factores tales como la velocidad de flujo, la densidad de carga sobre la partícula, la profundidad y naturaleza del lecho filtrante, etc.

Los filtros de profundidad están constituidos por una matriz de fibras o microesferas comprimidas y orientadas al azar. El resultado es una estructura tortuosa con múltiples canales de muy diversos tamaños. Ejemplos de este tipo de filtros son los de algodón, lana, papel poroso, porcelana, polímeros plásticos, vidrio y metal sinterizado y tierra de diatomeas. Entre sus ventajas podemos enumerar que retienen partículas en su superficie y también en su matriz interna, por lo que tienen una gran capacidad de retención cuantitativa de contaminantes. Las desventajas que poseen son:

no tienen un tamaño de poro definido. Su matriz formada al azar no permite establecer un límite de tamaño de partícula cuya retención será absoluta. Se asigna un tamaño de poro de manera en forma nominal.

debido a su estructura discontinua, se produce migración del medio filtrante, apareciendo fragmentos del propio filtro en la solución filtrada.

los microorganismos retenidos en su matriz pueden alcanzar la cara inferior del filtro para luego caer al líquido filtrado.

absorben líquido en su interior lo que genera mayor gasto económico en la filtración de líquidos costosos.

Los filtros de membrana están constituidos por una lámina uniforme, rígida y continua de material polimérico poroso. Algunos de los materiales utilizados en la fabricación de estos filtros son ésteres de celulosa y policarbonato, entre otros. Las ventajas que tienen son que poseen un tamaño de poro definido, la membrana es muy fina y retiene muy poco líquido. El medio filtrante no migra y no contamina el fluido filtrado. Su desventaja es que la retención de contaminantes se realiza exclusivamente en la superficie del filtro por lo que su capacidad de retención cuantitativamente es baja.

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El filtro, ya sea de membrana o de profundidad, se monta convenientemente sobre un soporte y se inserta en un kitasato receptor. El conjunto se esteriliza por calor húmedo.A fin de favorecer la filtración puede utilizarse presión positiva sobre el líquido no filtrado o conectar el recipiente receptor a un sistema de vacío. La presión positiva resulta más práctica pues permite el cambio de recipiente sin tener que manejar el filtro y, además, los filtrados que contienen proteínas no forman espuma. Otra ventaja del empleo de presión positiva es que se evita la posibilidad de contaminación del fluido filtrado debido a pequeñas pérdidas en el sistema de conexión o en el momento que se desconecta el sistema de vacío. Para evitar posibles contaminaciones del filtrado, cuando se utiliza un sistema de vacío, por la línea de conducción del vacío, se acopla al sistema un filtro de aire.

Controles de Esterilización

Son los controles que se efectúan par comprobar si se cumplieron las condiciones del método empleado. Existen distintos tipos de controles de esterilización:

biológicos. Utilizan suspensiones de esporas bacterianas, de resistencia conocida al tratamiento, que se secan sobre un soporte como tiras de papel de filtro, por ejemplo. Según el proceso que se desea controlar deben usarse los siguientes indicadores biológicos: para calor húmedo Bacillus stearotermophilus, calor seco Bacillus subtilis var. niger o Clostridium tetani, óxido de etileno Bacillus subtilis var. niger, radiaciones ionizantes Bacillus pumilus o Streptococcus faecium.

químicos. Son sustancias químicas de punto de fusión conocido y bien definido. Los esterilómetros son tiras de papel marcadas con óxidos minerales que cambian decolor al alcanzarse una determinada temperatura. Algunos indican temperatura y tiempo.

físicos. Consisten en registros de temperaturas que se realizan durante todo el ciclo de esterilización por calor. Un dispositivo capaz de efectuar este tipo de registro es la termocupla. Las termocuplas son alambres conductores y funcionan por un flujo de corriente eléctrica creado en un circuito continuo constituido por dos metales cuyas juntas se encuentran a dos temperaturas diferentes. Puede representarse mediante el siguiente diagrama

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A y B son dos metales, T1 y T2 son las temperaturas de las juntas respectivas, i representa la corriente termoeléctrica que fluye por el circuito. A es tomada como referencia termoeléctricamente positiva respecto de B, si T2 es la temperatura menor.

Control de esterilidad

Este ensayo es realizado sobre muestras o alícuotas del material que fue sometido a algún proceso de esterilización, con el fin de comprobar ausencia total de microorganismos viables. Medios de cultivo

Medio fluido tioglicolato (MFT) Este medio se utiliza para la investigación de gérmenes anaerobios. Contiene L-cisteína, dextrosa, NaCl, extracto de levadura, digerido pancreático de caseína, tioglicolato de sodio, resazurina, ágar al 0,075 %. pH=7.1. Condiciones de incubación: 30º C-35º C en aerobiosis.

Medio de tioglicolato alternativo Ídem anterior pero sin ágar. Condiciones de incubación: 30º C-35º C en atmósfera anaeróbica.

Medio caldo caseína-soja (CaSoy) Es un medio universal, sin inhibidores ni indicadores. Apto para el crecimiento de microorganismos exigentes por aportar una gran base nutritiva. Contiene: peptona de caseína, peptona de harina de soja, NaCl, K2HPO4, glucosa. pH=7.3. Condiciones de incubación: 20º C -25º C en aerobiosis.

Soluciones diluyentes y de lavado Peptona 0,1 %. pH=7.1. Peptona 0,1 % con Tween 80 (dispersante) al 0,1 %. pH=6.9.

Todo tipo de solución que se considere apropiada para disolver, diluir o lavar un artículo en ensayos de esterilidad no deberá tener efecto inhibitorio.

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Autoclave

BT1 Junta caliente

T2 Junta fría

A

Termocupla

i


Control de los medios empleadosSe deberá controlar la esterilidad de cada lote de medio empleado y la capacidad de permitir el desarrollo de los posibles gérmenes contaminantes.

La esterilidad de cada lote se puede confirmar mediante la incubación de un número representativo de medios, en condiciones de temperatura y tiempo específicos.

La capacidad de permitir el desarrollo se prueba inoculando cada tipo de medio empleado, por duplicado, con 10-100 microorganismos viables. A continuación se indican los microorganismos a inocular en cada medio de cultivo

ResultadosEl ensayo se considera positivo si hay desarrollo en todos los tubos sembrados dentro de los siete días. El ensayo es negativo si algún tubo no presenta desarrollo.

Procedimiento generalEl control de esterilidad puede realizarse según dos técnicas diferentes:

o transferencia directa al medio. Si la muestra a controlar es:a) líquida. Inocular la muestra con pipeta o jeringa estéril en los medios específicos para microorganismos aerobios y anaerobios. El volumen de muestra y el volumen de medio de cultivo se especifica en la tabla 1. Deben tomarse 20 muestras representativas conteniendo la muestra, se incubarán los tubos de control de medio, control de pipetas y demás controles que se consideren necesario, según el artículo controlado. Incubar todos los tubos durante 14 días, haciendo observaciones periódicas, por ejemplo: 1º al 5º día, 8º al 14º día. Los tubos de MFT se incubarán a 30-34ºC y los tubos de caldo CaSoy a 20-25ºC.b) sólida. Tomar una cantidad del producto (~ 300 mg) y transferirlo a 40 ml de caldo CaSoy y 40 ml de MFT. Si se trata de algodón, gasas, vestimenta de cirugía, hilos de sutura, etc. Sembrar la muestra en 40 ml de cada medio. Si se trata de muestras únicas de gran tamaño se sembrarán dos o más porciones de 100 a 500 mg de peso. Si el material esta acondicionado para su uso individual tomar porciones de 250 a 500 mg o toda la muestra si es menor que 250 mg.

o filtración por membrana. Se prepara la unidad filtrante adaptando el filtro con la membrana de 0,45 µm (esterilizado en autoclave) a un kitasato. La filtración puede realizarse mediante una bomba de vacío o sobrepresión.

a) Si se trata de muestras líquidas se filtra directamente un volumen determinado de cada muestra. Se lava con una solución de lavado. Terminada la filtración se desajusta el filtro y se toma la membrana con una pinza estéril, luego se la corta con una tijera estéril: una mitad se siembra en 100 ml de MFT, la otra se coloca en igual volumen de caldo CaSoy.

b) En caso de sólidos no filtrables (artículos que contienen recorridos estériles como sondas y guías) se pasa un volumen suficiente solución de peptona al 0,1 % más Tween 80 al 0,1 % a

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través de no menos que 20 muestras, de forma que se recuperen 100 ml de cada muestra. Se juntan todas las soluciones de lavado en recipientes estériles y se filtran a través de membrana. Una vez terminada la filtración se sigue como se mencionó anteriormente.

El método de elección, mientras sea posible, es por filtración. Este procedimiento es usado para líquidos y polvos solubles, que tengan efecto inhibitorio. Puede ser aplicado a cremas, aceites, ungüentos. También es útil para productos sin efecto inhibitorio. Asimismo, existen diseños que emplean la técnica de filtración para ensayos de esterilidad de sondas y guías, por ejemplo. Para la apertura de la muestra a controlar el exterior de los envases (ampollas, viales, frascos, bolsas, cartuchos, pomos, etc.) se debe limpiar con un agente decontaminante, por ejemplo alcohol al 70 % o formol al 5 %. Durante todo el ensayo se debe trabajar en área estéril y en forma aséptica.

Tabla 1Volumen mínimo de cada

medio Contenido de muestra

(ml) Mínimo

volumen de muestra

Transferencia directa al

medio

Técnica por filtración

Número de muestras por

medio menor de 10 ml 1 ml o todo el

contenido si es menor

15 ml 100 ml 20 ml

1 0 ml a menos de 50 ml 5 ml 40 ml 100 ml 20 ml 50 ml a menos de 100 ml 10 ml 80 ml 100 ml 20 ml

100 ml a 500 ml todo el contenido

-- 100 ml 10 ml

mayor de 500 ml 500 ml -- 100 ml 10 ml

Interpretación de los resultadosPrimera etapaExaminar a los intervalos mencionados todos los tubos sembrados según la presencia de turbiedad. Si no hay desarrollo el artículo reúne los requisitos del test de esterilidad. Si hay desarrollo pero revisando los controles de los materiales usados, procedimientos, etc., se encuentra que no hay asepsia en la técnica realizada, ésta primera etapa se considera invalidada y debe repetirse. Si hay desarrollo pero no existe evidencia de falta de asepsia, esta primera etapa es válida y debe realizarse una segunda etapa.

Segunda etapa

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Se trabajará con doble número de muestras ensayadas en la primera etapa. El volumen empleado de cada muestra, medios y condiciones de incubación no presentan variación. Si luego de la incubación no hay desarrollo en ninguno de los tubos el artículo reúne los requisitos del test de esterilidad. Si hay desarrollo y los controles evidencian alguna falla en la metodología se debe repetir esta segunda etapa. Si hay desarrollo pero no existe evidencia de falta de asepsia en la técnica empleada, el artículo no reúne los requisitos para pasar el test de esterilidad.

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