[cua0005s00]

Marcadores moleculares de ADN y su aplicación en frutales.

Autores: Juliette Valdes-Infante Herrero y Narciso N. Rodríguez. Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical.

Introducción: Los marcadores genéticos han sido ampliamente empleados para asistir en el manejo y el mejoramiento de los cultivos agrícolas. La primera fuente de marcadores fueron las variantes morfológicas, que tienen patrones Mendelianos simples de herencia. En los inicios del siglo 20, la transmisión de los marcadores morfológicos fue usada para monitorear la pureza de la semilla y para establecer grado de parentesco en cruces particulares. Desgraciadamente, estos marcadores tienen varias desventajas significativas. Primero, muy pocos están disponibles para asistir el mejoramiento de la mayoría de las cosechas. Segundo, muchos confieren algunas desventajas fenotípicas y su transmisión en los cultivares puede ser no deseada. Finalmente, la mayoría son recesivos, lo cual limita grandemente su utilidad (Clegg y colaboradores, 1999). En los 60, la invención de la técnica de isoenzimas proporcionó una nueva y rica fuente de marcadores genéticos. Las isoenzimas presentan varias ventajas para los genetistas de las cosechas: primero, son marcadores codominantes y por tanto proporcionan mucha más información acerca de los patrones de transmisión genética; segundo, las diferentes variantes aloenzimáticas (formas alélicas de las isoenzimas) no parecen conferir ninguna propiedad desventajosa en la planta de cultivo y tercero, es posible desarrollar desde 10 hasta 20 marcadores isoenzimáticos para la mayoría de las especies cultivables sin gran dificultad. No obstante estas ventajas, este método está limitado por un número relativamente pequeño de loci marcadores potenciales y por niveles modestos de polimorfismo. En los inicios de los 80, la rápida elaboración de la Biología Molecular comenzó a producir nuevas fuentes de marcadores genéticos. La primera fuente fueron los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (FRLPs), seguido por los ADNs polimórficos amplificados aleatoriamente (RAPD), seguido por los microsatélites ó secuencias simples repetidas (SSR) y por los polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP). Cada uno de estos métodos representó una mejoría sobre los anteriores. Todas estas técnicas basadas en el ADN pueden producir un número virtualmente ilimitado de loci marcadores y es esto lo que los hace tan poderosos (Clegg y colaboradores, 1999 ). Las principals diferencias entre estos métodos son si este es basado en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), como es el caso de los RAPD, SSR y AFLP ó basado en transferencias Southern (RFLP) (Clegg et al.,1999; Valadez y Kahl, 2000); si son codominantes (RFLP, SSR, AFLP) o recesivos (RAPD) y en el costo de desarrollar los reactivos de los marcadores (por ejemplo, los cebadores para los SSR, los fragmentos clonados para los RFLP, etc). Estos marcadores permiten visualizar diferencias tangibles entre las secuencias homólogas del ADN de los organismos. Esas diferencias resultan de cambios o rearreglos entre los pares de bases que conforman este tipo de molécula, tales como: translocaciones, inversiones, inserciones o deleciones en regiones homólogas. Detectan variaciones directas a nivel del ADN y tienen ventajas tales como el hecho de ser dominantes o codominantes, de desarrollarse de manera estable, de carecer de efectos pleiotrópicos y sobre todo, de no estar sujetos al ambiente en donde se desarrolla el organismo en estudio, principalmente. Las propiedades mencionadas hacen que estos sean extremadamente útiles, comparados con los análisis a escala morfológica o de proteínas (del tipo de las isoenzimas). Para obtener marcadores de ADN se usan diferentes métodos que se pueden agrupar de manera convencional en tres categorías. La primera categoría se basa en la técnica conocida como

hibridación tipo ¨Southern¨. Esta técnica tiene el propósito de explorar las variaciones en la longitud de los fragmentos de ADN, ocasionados por la restricción del genoma con alguna endonucleasa particular. En esta categoría se incluye a los RFLP y los VNTR (Restriction Fragment Length Polymorphism y Variable Number of Tandem Repeats). La segunda categoría agrupa las metodologías basadas en la tecnología de la Reacción de Polimerización en Cadena o PCR (Polymerase Chain Reaction). Esta tecnología utiliza secuencias de oligonucleótidos que inician la síntesis in vitro de fragmentos de ADN de longitudes variables. Estas secuencias iniciadoras pueden ser aleatorias, semialeatorias o específicas, con las cuales ha sido posible caracterizar genomas de diferentes organismos, detectar y aislar genes, e incluso, diferenciar organismos relacionados genéticamente. Para esta tecnología ,se pueden citar por ejemplo, las metodologías que generan los RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR), DAF(DNA Amplification Fingerprinting), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism), entre otras. La tercera categoría involucra metodologías que combinan la PCR o sus productos de ADN más la hibridación tipo Southern. Por ejemplo la técnica de RAHM (Random Amplified Hybridization Microsatellites) o llamada también RAMPO(Random Amplified Microsatellite Polymorphism), requiere de la síntesis previa de ADN con cualquiera de las metodologías de la PCR y la posterior hibridación con alguna sonda que detecte microsatélites (Valadez y Kahl, 2000). Para cualquier problema bajo investigación, es la naturaleza de éste la que debe determinar el método de análisis. No siempre el más moderno es el mejor o la forma más efectiva para tratar el problema.

Marcadores Genéticos de ADN • Marcadores basados en la hibridación tipo Southern. Ø Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Los marcadores de ADN son secuencias genómicas localizadas en un mismo locus pero que difieren en su secuencia de bases nitrogenadas. Esas variaciones, como ya se mencionó, son consecuencia de varios eventos de mutaciones que se manifiestan en los genomas que se comparan. Par detectar algunas de estas mutaciones se utiliza la técnica denominada RFLP. Esta tecnología expresa diferencias en sitios específicos del ADN que fueron reconocidos por enzimas de restricción particulares (endonucleasas). Cada una de las numerosas endonucleasas, cuyo origen es bacteriano, reconocen y cortan solamente una secuencia específica de bases nitrogenadas en el ADN, siempre y cuando estas no estén protegidas (metiladas); pero si la adenina o la citocina en esas secuencias estuvieran metiladas, entonces el corte no podría realizarse por la enzima involucrada. Considerando lo anterior, cualquier otro ADN que no estuviera metilado, podría ser reconocido y cortado en fragmentos de longitud definida; y cualquier mutación dentro de esos sitios, podría cambiar el patrón del fragmento y permitir que se detecte un RFLP al comparar dos o más genomas (Valadez y Kahl, 2000). Para la detección de los RFLPs, en primer lugar, es necesario aislar el ADN del organismo de interés, purificarlo y cortarlo con una o más endonucleasas de restricción. Los fragmentos resultantes se separan en un gel de agarosa por elctroforesis y se transfieren a una menbrana que puede ser de nailon o de nitrocelulosa (¨Southern blotting¨). La subsecuente hibridación con alguna sonda marcada y detección con autorradiografía, luminografía o quimioluminiscencia (dependiendo del tipo de marcaje) hará visible un fragmento de ADN específico, que puede ser comparado con el fragmento resultante de otros genomas tratados de la misma forma. Las sondas que se utilizan para RFLPs se obtienen de fragmentos de ADN nuclear, de organelos, o bien de secuencias transcriptas como es el caso de ADN complementario (ADNc). El grado de polimorfismo detectado con RFLPs, difiere ampliamente entre las especies de plantas dependiendo de la sonda utilizada. Por ejemplo las sondas de copia única revelan un amplio grado

de polimorfismo en maíz y col, mientras que en especies como el cacahuete, frijol, chícharo y melón, no se detecta una variabilidad amplia. Entre las características de los RFLPs se encuentran su omnipresencia debido a que puede estar en todos los tejidos, su naturaleza codominante, que presentan una herencia mendeliana simple, el nivel de polimorfismo que detectan es alto ya que son capaces de detectar variantes alélicas. El número de loci que detectan es de 1-3, presentan una dificultad técnica intermedia, laconfiabilidad es alta. Otro elemento a destacar es que requieren DNA relativamente puro en concentraciones de 2-10µg y utilizan radioisótopos (Waugh y Powell, 1992). Generalmente, los RFLPs sirven como marcadores moleculares que se han utilizado para construir mapas genéticos con selección asistida por marcadores, para la clonación de genes basados en mapas para la identificación de cultivares, o para ayudar a resolver problemas de índole taxonómica o filogenética. Los RFLPs brindan patrones altamente reproducibles pero las variaciones en las longitudes de los fragmentos entre individuos o especies aparecen, ya sea cuando las mutaciones alteran el sitio de restricción o como resultado de una inserción/deleción entre ellos. Sus principales limitaciones técnicas son las siguientes: se necesita un buen suministro de sondas; los pasos de hibridación y secado son consumidores de tiempo y difíciles de automatizar y se requieren cantidades suficientes de ADN de buena calidad (10µg por digestión), por lo que no son aplicables donde se dispone de una cantidad muy limitada de fuente de material o tejido preservado (Karp y colaboradores, 1996). Además solamente se detecta una fracción de la variabilidad de secuencias existentes en el genoma; es decir, su información es limitada (Valadez y Kahl, 2000). Sin embargo, los RFLPs clásicos que aquí se describen están actualmente fuera de moda, debido a que su detección es muy laboriosa y costosa. En su lugar los reemplazan otras técnicas que también están basadas en la variación de la secuencia de los sitios de reconocimiento de las endonucleasas de restricción. Una de esas técnicas explora, por ejemplo, la presencia de cantidades considerables de DNA repetidas y distribuídas en el genoma de los eucariontes, usando sondas de microsatélites. Este tipo de oligonucleótido revela un alto grado de polimorfismo en un amplio espectro de plantas, incluyendo aquellas en las que la detección es pobre con el uso de sondas de copias únicas; e incluso es posible distinguir diferencias individuales, por lo que pueden utilizarse para estudios de huellas genómicas. La complejidad técnica de la ejecución del análisis FRLP unido al amplio uso de radioisótopos de corta vida en el método de detección, ha puntializado un debate acerca de si es factible la aplicación rutinaria de los FRLPs en programas de mejoramiento de las cosechas a gran escala (Waugh y Powell, 1992). La técnica RFLP ha sido utilizada, por ejemplo, en el mejoramiento del aguacatero. La aplicación de una batería de sondas RFLP a las preparaciones de 3 líneas tolerantes a la pudrición de las raíces causada por Phytophthora cinnamomi, permitió la diferenciación entre estas, ya que cada línea pudo ser identificada con un único genotipo (Clegg y colaboradores, 1999); poniendo de manifiesto la utilidad de esta técnica para la identificación de individuos como se comentó anteriormente. Se ha demostrado también su importancia en la identificación de cultivares de mango, donde se obtuvieron patrones específicos para cada cultivar, al ser el ADN genómico digerido con Hind III o Dra I (Adato y colaboradores, 1995). Este método es también aplicable a estudios sobre relaciones genealógicas del cultivo del aguacate, donde se obtuvieron se pudo distinguir entre todos los cultivares estudiados y al hacer un análisis de agrupamiento con estos datos, se obtuvieron 3 grupos correspondientes con las 3 clases botánicas del aguacate más dos grupos adicionales que parecen representar los cultivares con un origen híbrido intervarietal (Clegg y colaboradores, 1999). Dentro de esta misma línea existen reportes sobre su uso en la taxonomía y la filogenia del germoplasma de las especies del género Musa (plátano)(Crouch y colaboradores, 1998); así como la variación cloroplástica dentro del género (Crouch y colaboradores, 1998). Asimismo, está también su empleo para estudios evolutivos y taxonómicos en Citrus y otras especies (Deqiu y

colaboradores, 1998) y en el establecimiento de las relaciones filogenéticas entre 13 especies de Mangifera con 20 endonucleasas de restricción, de las cuales solo 4 revelaron 8 sitios informativos de mutación que permitieron clasificar las especies en dos grupos. Las especies pertenecientes al mismo grupo son monomórficas para la digestión con todas las enzimas probadas. El estudio permitió conocer la baja diversidad en la región amplificada de ADNcp entre las especies analizadas (Eiadthong y colaboradores, 1999). Es importante destacar también su utilidad en estudios de diversidad molecular, como por ejemplo, en el caso de la piña (Ananas comosus (L.) Merr), donde se analizaron un grupo de accesiones y los resultados obtenidos mostraron que la variación dentro del género Ananas parece ser continua y se da fundamentalmente a nivel intraespecífico. Además, se evidenció la existencia de flujo de genes (Duval y colaboradores, 2001). También está el caso de su uso, con este mismo objetivo, en el germoplasma dentro y entre E.oleifera , con accesiones que son representaciones del área geográfica de distribución de ésta. Los resultados mostraron una fuerte estructura relacionada con el origen geográfico. Este estudio permitió poner de manifiesto la confiabilidad de esta técnica ya que los resultados obtenidos tuvieron un alto grado de correspondencia con los revelados por la técnica novel de AFLP (Barcelos y colaboradores, 1998). Esta correspondencia de resultados también se observó en el análisis de las relaciones filogenéticas dentro del género Citrus, pero esta vez con la técnica RAPD, donde los resultados fueron similares en su gran mayoría (Deqiu y colaboradores, 1998). No obstante, no siempre los resultados son satisfactorios, como en la determinación de la variabilidad genética de accesiones trifoliadas (Poncirus trifoliata), donde tanto las isoenzimas como los RFLPs detectaron un polimorfismo muy bajo, mientras que con otra técnica adicional (ISSR) mostraron un polimorfismo mayor (Deqiu y colaboradores, 1997). Por esto, en ocasiones, cuando pueda existir alguna duda, es necesario la aplicación de varias técnicas para corroborar los resultados y que estos sean, por tanto, confiables. Ø Repeticiones en Tandem de Número Variable (VNTR) Otra técnica poderosa para el estudio de la diversidad utiliza regiones hipervariables del genoma que comprenden secuencias simples repetidas en tandem. Estas repeticiones varían en el número (y por tanto en su longitud) y son generalmente llamadas VNTR, aunque es utilizado el término microsatélite (SSR) ó minisatélites cuando la unidad básica repetida está alrededor de las 2-8 pares de bases (pb) de longitud o mayor respectivamente. Los minisatélites se caracterizan además, por contener regiones ricas en GC, que con frecuencia hibridan entre especies diferentes (Valadez y Kahl, 2000). Ambas categorías de DNA pueden estar presentes en cualquier sitio en el genoma (Karp y colaboradores, 1996; Valadez y Kahl, 2000). Cuando se hibridiza al DNA sondas de oligonucleótidos sintéticos que contienen estas repeticiones, se producen usualmente perfiles multibandas. Estas huellas VNTR son altamente discriminativas generalmente y son utilizadas a menudo para distinguir variedades o incluso individuos y revelan parentesco e identidad. Aunque los VNTR pueden estar en varios sitios del genoma, las secuencias flanqueadoras en estos sitios pueden ser únicas. Si un VNTR individual es clonado, se pueden obtener cebadores de estas regiones flanqueadoras, convirtiéndose entonces el VNTR en un sitio de secuencia marcada (SSR). Los minisatélites son más difíciles de utilizar en este sentido debido a su tamaño (Karp y colaboradores, 1996). Las repeticiones de secuencias simples ó microsatélites, son intervalos de ADN con unidades penta, tetra, tri, di o mononucleotídicas repetidas en tandem (Crouch y colaboradores, 1998; Powell y colaboradores, 1996), que están dispuestas en todo el genoma de la mayoría de las especies eucarióticas.

La frecuencia relativamente baja de éstos en el genoma de las plantas (una repetición mayor que los 20pb ocurre cada 33Kb en el genoma nuclear de las plantas comparado con cada 6Kb en los mamíferos), presenta problemas técnicos para el aislamiento de los SSR a gran escala. Adicionalmente, los dinucleótidos A-T, los cuales son el tipo de SSR más abundante en las plantas, son difíciles de aislar de las librerías debido a que son polindrómicos (la secuencia es la misma cuando una cadena es leída de izquierda a derecha o la otra de derecha a izquierda). Weber y May (1989) desarrollaron una aproximación general para la detección de microsatélites polimórficos: el polimorfismo es revelado por amplificación del ADN genómico, usando dos únicos cebadores que flanqueen, y por tanto definan el locus microsatélite. Los productos amplificados serán revelados en geles. Los métodos estándar para el aislamiento de los SSR involucran: la creación de una pequeña librería genómica; el escreaning de la librería por hibridación; la secuenciación de los clones positivos; designación del cebador y análisis de la PCR locus específica e identificación de los polimorfismos (Powell et al., 1996; Crouch y colaboradores, 1998). Los métodos de enriquecimiento preclonaje involucran la fragmentación del ADN genómico por sonicación o digestión con endonucleasas y la creación de fragmentos de ADN con secuencias definidas en ambos extremos. Esto puede lograrse por ligazón de adaptadores ó con el uso de cebadores no específicos y análisis de la PCR. Los fragmentos que contienen microsatélites son enriquecidos por hibridación a un SSR de corta longitud biotinilado y una selección subsecuente enbolitas magnéticas cubiertas con estreptovidina (Powell y colaboradores, 1996). El aislamiento de los SSR a pasado a ser una técnica más rutinaria con la disponibilidad de facilidades de secuenciación del ADN automatizadas y las mejoras en las técnicas para la construcción de librerías genómicas enriquecidas con SSR y en las del escreening de los clones apropiados (Crouch y colaboradores, 1998). La variación en los SSRs resulta de diferencias en el número de unidades repetidas. Se piensa que estas diferencias son causadas por errores en la replicación del DNA (Crouch y colaboradores, 1998), o sea, la DNA polimerasa se desliza cuando está copiando la región repetida, cambiando el número de repeticiones (Jarne y Lagoda,1996). Es probable que los cambios grandes en el número de repeticiones son producto de procesos tales como una recombinación desigual (Strand y colaboradores, 1993). Tales diferencias son detectadas en geles de poliacrilamida, donde migran diferentes distancias de acuerdo a su tamaño. Los SSrs han pasado a ser marcadores muy atractivos en el mejoramiento molecular y la valoración de la diversidad (Rivera y colaboradores, 1999). La primera aplicación de los SSRs en las plantas ha sido en la identificación de los cultivares, donde estos han sido empleados para genotipar inequívocamente, material tan diverso como uva y soja (Powell y colaboradores, 1996). Otra aplicación es en la determinación del hibridismo. Para este propósito, la naturaleza codominante de los SSR es particularmente importante y brinda la contribución alélica de cada parental para ser detectada en híbridos somáticos o sexuales (Powell y colaboradores, 1996). Una de las principales razones par desarrollar microsatélites es su uso potencial como marcadores diagnóstico para caracteres importantes en programas de mejoramiento de plantas. Se ha publicado recientemente el primer ejemplo de un SSR ligado a un gen de resistencia a enfermeda des en plantas (35). Una repetición (A-T)13, localizada dentro del gen que codifica para una proteína de shock térmico de la soja, está a 0.5 centimorgan (cM) de Rsv, el cual es el gen que confiere resistencia al virus del mosaico de la soja. Se ha pensado que los SSRs son las nuevas aloenzimas, ya que detectan variación al nivel de loci. Por esto muchos de sus usos han sido donde anteriormente se han empleado aloenzimas. Dentro de los ejemplos están los estudios de diversidad (Rosetto y colaboradores, 1999), flujo de genes y sistemas de cruzamientos (Chase y colaboradores, 1996) y análisis de paternidad (Streiff y colaboradores, 1999). Rosetto y colaboradores(1999) estudió el fraccionamiento de la variación

dentro y entre las poblaciones de Melaleuca alternifolia (Myrtaceae) para facilitar la identificación de recursos genéticos y para asistir en la conservación de la diversidad genética. Muchos estudios de SSRs parecen ser extensiones de grupos que han sido estudiados usando marcadores bioquímicos o moleculares. El estudio de Rosetto y colaboradores (1999) sobre la estructura genética en Melaleuca alternifolia , es una extensión del estudio con aloenzimas de Butcher y colaboradores(1992), aunque Rosetto y colaboradores(1999) usaron un número mayor de individuos y poblaciones. Otros estudios han sacado partido de la alta variabilidad de los SSRs para reestudiar especies en las cuales otros métodos han encontrado poca o ninguna variación. Muchos estudios iniciales con SSRs han sido confinados a un único taxa, o sea, al taxon por el cual fueron desarrollados. La razón de esto parece ser debido a la conocida incapacidad de los cebadores SSRs de amplificar DNA en especies diferentes a la cual ellos fueron diseñados; lo cual puede ser la causa de por qué se ha publicado tan pocos estudios de sistemática usando SSRs. La capacidad de usar el mismo cebador SSR en diferentes especies de plantas dependerá de cuán conservado esté el sitio flanqueador del SSR entre las taxas relacionadas y la estabilidad de los SSR en el tiempo. Algunos estudios han indicado que los cebadores SSRs pueden amplificar la misma región SSR en taxas relacionadas muy estrechamente (Powell y colaboradores, 1996). Por ejemplo, White y Powell (1997) examinaron Meliaceae usando cebadores designados para Swietenia humulis (White y Powell, 1997b). Ellos fueron capaces de amplificar DNA en 7 de los 11 loci microsatélites en otras especies de Swietenia, 6 loci en otros géneros de la misma raza y 4 de 6 loci en especies de la misma familia. Esto ha estimulado el desarrollo de algunos estudios filogenéticos. Por ejemplo, Mhameed y colaboradores(1997) estudiaron las relaciones entre el aguacate (Persea americana Mill) y especies de Persea silvestres y presentó un árbol filogenético usando el método de parsimonia. El valor de los microsatélites se desprende de su naturaleza multialélica, debido a la alta probabilidad de mutación que estos loci presentan (Karp y colaboradores, 1996; Morgante y Olivieri, 1993); transmisión codominante, fácil detección por la PCR, relativa abundancia, cobertura extensiva del genoma y requerimiento de solo una pequeña cantidad de ADN iniciador (Powell y colaboradores, 1996) Además brindan perfiles altamente reproducibles (Karp y colaboradores, 1996) y confiables (Powell y colaboradores, 1996). Como los AFLPs, la mayor ventaja de los SSRs es el gran número de polimorfismo que revelan (Morgante y Olivieri, 1993; Powell y colaboradores, 1996). Además, la capacidad del método de diferenciar individuos cuando se examina una combinación de loci, hace que la técnica sea muy útil para experimentos de flujo de genes, identificación de cultivares y análisis de paternidad (Hokanson y colaboradores, 1998). Debido a que solo examinan un loci por vez, no son directamente comparables con los AFLPs. La comparación debe ser con marcadores a nivel de loci como RFLPs e isoenzimas. Por ejemplo, Rosetto y colaboradores(1999) encontró uhn valor de heterocigosidad observada mucho mayor utilizando SSRs en Melaleuca alternifolia que el obtenido con aloenzimas (Butcher y colaboradores, 1992). McCouch y colaboradores(1997) comparó el número de alelos revelado por RFLPs y por loci SSR en arroz (Oryza sp) y encontró de 2 a 25 alelos por loci SSR comparado con de 2 a 4 por loci RFLP. Distinto a los AFLPs, los SSRs son codominantes, por lo que el heterocigoto puede ser identificado confiablemente. Esta característica incrementa la eficiencia y la exactitud de las medidas de la genética poblacional comparado con otros marcadores como AFLP y RAPD. Además, la identidad de los heterocigotos en la generación F1 hace más simples los análisis de flujo de genes, hibridación y paternidad (Schlötterer y Pemberton, 1994). Otra de las ventajas es que se puede utilizar material de hoja seca. Entre sus desventajas más importantes cabe señalar la necesidad del uso de la clonación y la secuenciación, así como de geles de alta resolución (Powell y colaboradores, 1996). Los problemas que se pueden presentar con esta técnica se pueden dividir en tres categorías: prácticos (a), de datos (b) y de análisis (c).

(a) .1 Escreening para los SSRs. A menos que se hayan diseñado cebadores útiles en estudios anteriores, es necesario escrinear un organismo en busca de los SSRs. Existen muchas formas diferentes de hacerlo. Todas son complejas en lo referente a la manipulación y caras, y pueden producir solo un pequeño número de loci SSR potenciales. .2 Deslizamiento. Esto puede ser un problema significativo cuando se analizan repeticiones mono y dinucleotídicos (Ciofi y colaboradores, 1998). Durante el proceso de amplificación, la termopolimerasa puede deslizarse, conllevando a la formación de productos de tamaño diferentes (Ciofi y colaboradores, 1998) que difieren de 1 a 5 unidades repetitivas aproximadamente del producto esperado. Tales productos son usualmente menos intensos que el producto deseado, de forma tal que en la práctica puede ser desestimado generalmente. Sin embargo, si el producto de un individuo heterocigoto se solapa, entonces algunas veces es difícil diferenciar el producto verdadero y el deslizado (Ciofi y colaboradores, 1998) .3 Problemas prácticos adicionales. La identificación inexacta de un alelo puede ser causada por la tendencia de la Taq polimerasa de adicionar un nucleótido de adenosina al extremo 3’ del producto amplificado (Ciofi y colaboradores, 1998). La adición se determina por un método templado-específico o marcador específico, lo cual puede no ser un problema si el nucleótido extra está adicionado siempre o nunca. Sin embargo, pueden aparecer errores en la determinación del tamaño si este nucleótido es adicionado solo ocasionalmente. (b) .1 Homología. Este es el mayor problema que enfrenta el uso de los SSR en los análisis de filogenia. Los SSRs asumen que los fragmentos co-migrantes son homólogos, existiendo solo unas pocas razones a priori para asumir esto.Además, la no-homología puede dividirse en aquellas que ocurren dentro de las regiones flanqueadoras de los SSRs y las de las regiones SSR repetidas. Varios estudios han secuenciado SSRs amplificados para probar la homología y los mecanismos de mutación SSR (Blanquer-Maumont y Crouau-Roy, 1995; Grimaldi y Croau-Roy, 1997; Buteler y colaboradores, 1999). Blanquer-Maumont y Croau-Roy (1995) secuenciaron los SSRs que amplificaron en humanos y en contraron variaciones en las regiones flanqueadoras no repetidas. La variación constó tanto de mutaciones puntuales como de indels. Las primeras no cambian la longitud del producto de SSR pero las segundas sí, causando probablemente malinterpretaciones. Por ejemplo, Grimaldi y Crouau-Roy (1997) secuenciaron todos los alelos de la repetición (CA)n en humanos y encontraron ambas cosas en la región flanqueadora del SSR. Ellos encontraron una inserción de 6pb en esa región. Esta mutación pudiera posiblemente causar una mala identificación de los alelos si solo se mide el tamaño de estos, o sea, el alelo (CA)20, que contiene la inserción, pudiera co-migrar con el alelo (CA)23 que no la tiene (Grimaldi y Crouau-Roy, 1997). Buteler y colaboradores(1999), en su caracterización de papas dulces diploides y poliploides (Ipomea trifida e I.batatas ), encontró tanto mutaciones como indels en una proporción mayor que en los humanos, por lo cual sugirió que se deben tomar precauciones cuando se cuenta exclusivamente con el tamaño de la banda en la interpretación de los polimorfismos de longitud SSRs.La inclusión de estos fragmentos no homólogos en el análisis probablemente provocarán un sesgo en los resultados y romperán con las suposiciones del análisis filogenético. Ujino y colaboradores(1998) señalaron otro problema con la homología que se presenta cuando se analizan repeticiones compuestas. Si se considera un SSR con secuencia 5’-(CT)10CA(CT)8-3’ y un segundo alelo es 2pb mayor y no está secuenciado; es imposible decir cuál repetición incrementó

en tamaño (5’-(CT)11CA(CT)8-3’ ó 5’-(CT)10CA(CT)9-3’). Uno pudiera esperar un porcentaje mayor de fragmentos no homólogos si la repetición analizada es compuesta. Esto fue reconocido cuando Ujino y colaboradores(1998) recomendaron que deben usarse repeticiones simples solamente, con el objetivo de limitar errores en la identificación de los genotipos. La tercera y más problemática incertidumbre en la homología es dentro de la unidad repetida. Esto es, si dos fragmentos que co-migran son idénticos por descendencia o por estado. Asumiendo que el modelo de mutación paso a paso (SSM) es una forma buena de describir la evolución de los SSRs. Consideremos el caso de dos alelos (CA)6. El alelo (CA)6 puede provenir ya sea de un alelo (CA)7 o de uno (CA)5. Se asume que todas las accesiones con alelo (CA)6 son idénticas por descendencia, pero existen pocas razones para asumir esto. Seis posibles mutaciones incrementarán al alelo (CA)5 a (CA)6, más 7 mutaciones adicionales que pudieran disminuir el alelo (CA)7 a (CA)6. El problema de la homología depende de la probabilidad de mutación de las repeticiones. Si esta es baja, entonces la probabilidad de que una mutación sea única y de que alelos similares sean idénticos por descendencia es alta y viceversa, si el rango de mutación es alto entonces incrementa la probabilidad de que dos alelos co-migrantes sean idénticos en estado y no homólogos. El inconveniente del uso de los SSR en la sistemática es debido probablemente al gran número de alelos co-migrantes. La incidencia de la no homología puede sesgar las medidas de similitud y frecuencia, así como las medidas basadas en caracteres (Swofford y colaboradores, 1997). .2 Alelos nulos. Las mutaciones en la región de unión de uno o de los dos cebadores SSR pueden inhibir el annealing, lo cual puede provocar la reducción ó pérdida del producto de PCR(Callen y colaboradores, 1993). Tales productos son llamados alelos nulos y son comparables, por sus efectos, a los identificados por las aloenzimas. Los alelos nulos pueden manifestarse como un menor número de heterocigotos que el esperado en una población con cruzamientos al azar o por la aparición de líneas vacías (Morgatce y colaboradores, 1998). Esto quiere decir que si en un heterocigoto con dos alelos SSR diferentes, uno de estos alelos no puede ser amplificado debido a dificultades en el annealing de los cebadores,; entonces el fenotipo (en el gel de SSR) aparecerá como un homocigoto de una sola banda. Son también responsables de desigualdades entre el par parental-descendencia (la descendencia no amplifica un alelo que está presente en los parentales. Por ejemplo, Rosetto y colaboradores(1999) encontraron una menor heterocigosidad observada para Melaleuca alternifolia que la esperada y además un exceso significativo de homocigotos, lo cual sugiere que puede ser resultado de alelos nulos. Este mismo colectivo de autores argumentaron que debido a que los cebadores utilizados estaban basados en cebadores homólogos para esta especie, era menos probable la aparición de alelos nulos. Sin embargo, Callen y colaboradores(1993) identificaron alelos nulos utilizando cebadores homólogos. El uso de cebadores heterólogos probablemente incrementa la incidencia de detección de estos alelos. Dowling y colaboradores(1997) sugieren que estos alelos pueden sesgar la estimación del genotipo y las frecuencias alélicas, mientras Lamboy (1994) ha mostrado que pueden sesgar la estimación de las medidas de distancia y de similitud. (c) La variación SSR puede ser analizada filogenéticamente en dos formas: i) presencia o ausencia de alelos como carácter, calculando distancias o usando medidas de carácter y ii) frecuencia alélica al nivel de loci como caracteres, calculando medidas de distancia. El uso de los SSR para análisis filogenético no está garantizado. El problema potencial de la no-homología de los alelos co-migrantes, la presencia de alelos nulos y la falta de un método riguroso

de análisis de los datos resultantes evita su uso en estudios de sistemática, excepto para grupos separados por no más de unas pocas miles de generaciones (Jarne y Lagoda, 1996). La técnica SSR permite demostrar que puede existir una correlación entre los resultados obtenidos por mediación de técnicas moleculares y la carcterización morfológica de las varidades, como lo evidencia el estudio realizado para establecer las relaciones filogenéticas entre los diferentes cultivares de aguacate (Persea americana Mill) y las especies de Persea. En el trabajo se realizó lqa caracterización morfológica en base a 6 caracteres y los cultivares analizadso fueron ubicadso en su respectiva clase atendiendo a esto. Posteriormente, se realizó un análisis SSR con estos cultivares, obteniéndose como resultado que los patrones SSR corroboraron la clasificación de 8 de los 9 cultivares determinados morfológicamente como mejicanos; 5 de los 6 clasificados morfológicamente como antillanos y otro tanto con 6 de los 8 asignados a la clase guatemalteca (Mhameed y colaboradores, 1997). También los SSR son útiles en la identificación de cultivares, como es el caso del estudio de Lavi y colaboradores(1994) en el aguacate, donde las combinaciones de SSRs analizadas pudieron distinguir entre 12 cultivares excepto para el Hass y el Gwen; lo cual no es sorprendente ya que Hass es el parental femenino de Gwen. No obstante los buenos resultados, no se detectó ningún patrón de clase, debido quizás a que el número de representantes de cada clase era muy pequeño (de 2 a 3). Sin embargo, se demostró la naturaleza codominante de estos marcadores, ya que 24 de 26 descendientes de un cruce entre 2 cultivares específicos mostraron ser híbridos verdaderos al presentar una banda de cada parental. Siguiendo esta misma línea está el trabajo de Dror y colaboradores(1992) con Carica papaya y otras especies del género Carica. Las sondas empleadas en el estudio mostraron un patrón polimórfico diferente entre las especies de Carica y entre los cultivares de C.papaya. El alto grado de polimorfismo detectado por este método permitió analizar las relaciones genéticas dentro de Caricaceae basado en el compartimiento de bandas, posibilitando seleccionar los pares de especies relacionados más estrechamente y los menos relacionados. En el caso de la uva (Vitis vinifera L.), han permitido identificar todas las accesiones analizadas en el estudio de Ulanowsky y colaboradores(2000), existiendo una corcondancia general entre estos resultados y los obtenidos por RAPDs con estas mismas accesiones. También ha sido posible corregir identificaciones erróneas para este cultivo con esta técnica e incluso, determinar que su estructura genética ha sido influenciada por una fuente selección artificial guiada por el hombre. Con esta técnica se puede detectar un alto nivel de polimorfismo, como lo muestra el estudio preliminar con muestras de coco de Filipinas, en el cual, de todos los SSRs analizados, solo 3 no fueron polimórficos y el número de alelos detectados fue de 2-9 para cada uno. Al chequear los resultados obtenidos por esta técnica respecto a lo ya conocido sobre el germoplasma de coco se comprobó, como se esperaba, la separación clara entre los cultivares altos y los enanos; poniendo de manifiesto la confiabilidad de esta técnica. Un resultado más sorprendente fue la detección de loci heterocigotos a muy alta frecuencia en algunos de los cultivares enanos, lo cual pude sugerir que quizás hubo una polinización cruzada en el origen de estos cultivares (Rivera y colaboradores, 1999). También está el trabajo de Crouch y colaboradores con individuos de las poblaciones mejoradas del género Musa (plátano), donde los SSR fueron capaces de detectar un alto nivel de polimorfismo. Se han reportado varios cientos de marcadores para este género en los trabajos de Jarret y colaboradores, Lagoda y colaboradores, Kaemmer y colaboradores y Crouch y colaboradores (Crouch y colaboradores, 1998). Su aplicación también puede ser llevada a la genética poblacional par la diferenciación entre poblaciones y el análisis del nivel de diversidad que hay entre éstas. Con esta finalidad, Perera y colaboradores(1999), estudió las poblaciones de coco de Sri Lanka empleando formas pertenecientes a las 3 variedades reportadas para este país(típica(tipo alto), nana(tipo enano) y aurantiaca(intermedio entre enano y alto)). Los resultados mostraron que los cocos altos exhiben niveles de diversidad mayores que los enanos y los intermedios y que estos últimos son más

similares a los enanos que a los altos. Aquí se pone nuevamente de manifiesto la confiabilidad de esta técnica, ya que se obtuvieron iguales resultados usando AFLP en el mismo grupo de genotipos en un estudio previo realizado por Perera y colaboradores (Perera y colaboradores, 1999). Los inter-SSR son una variante de la técnica RAPD, aunque probablemente son más rigurosos que ésta debido a la alta temperatura de annealing (Robinson y Harris, 2000) La amplificación ISSR es una técnica que puede diferenciar rápidamente individuos relacionados estrechamente. Involucran la amplificación por la PCR del ADN usando un único cebador compuesto de una secue ncia de microsatélite anclado al extremo 3’ ó 5’ por 2 - 4 nucleótidos arbitrarios y a menudo degenerados. Acoplado con la separación de los productos de amplificación en geles de poliacrilamida, la amplificación ISSR puede revelar muchos más fragmentos por cebador que los RAPDs (Deqiu y colaboradores, 1998). Los marcadores ISSR tiene varias ventajas: generan grandes cantidades de bandas, por lo cual pueden distinguir accesiones relacionadas muy estrechamente más confiablemente que otras técnicas y son menos caros que RFLP ó RAPD (Deqiu y colaboradores, 1997). Han sido utilizados, por ejemplo, para el genotipaje de más de 1200 vides, permitiendo la diferenciación clonal de los cultivares en correspondencia con los resultados obtenidos por RAPD (Regner y colaboradores, 2000). También son útiles para el estudio de relaciones filogenéticas, como es el caso de accesiones del género Citrus representando a 35 especies de éste. Con pocos cebadores se obtuvo un número alto de fragmentos IISR polimórficos que permitieron clasificar las accesiones en 5 grupos principales. Las relaciones filogenéticas reveladas por esta técnica tuvieron gran correspondencia con clasificaciones taxonómicas previas (Deqiu y colaboradores, 1998). Otro de sus usos ha sido en la determinación de variabilidad genética. Dentro de esta línea está el trabajo de Deqiu y colaboradores(1997) para la caracterización de accesiones trifoliadas (Poncirus trifoliata ), donde tanto las enzimas como los RFLPs detectaron un bajo polimorfismo y la aplicación de los inter-SSR permitió la caracterización de las mismas y su división en 4 grupos principales. Se ha reportado recientemente la aparición de repeticiones mononucleotídicas polimórficas en el genoma cloroplástico de las plantas superiores, lo cual provee de alternativas para detectar polimorfismo cloroplástico intraespecífico (Powell y colaboradores, 1996). • Marcadores basados en la reacción de polimerización en cadena (PCR). El análisis de los RFLPs mediante la hibridación tipo Southern, como ya se mencionó, presenta ciertos problemas como técnica de rutina en las prácticas de mejoramiento de plantas. Para resolver estos problemas, se ha generado una metodología que utiliza el ADN a investigar como plantilla, para sintetizar convenientemente fragmentos discretos de ADN. Esta tecnología conocida como PCR tiene la finalidad de detectar una secuencia o gen de interés en el genoma de un individuo. Presenta varios requerimientos, entre los cuales es indispensable un molde de ADN, moléculas inic iadoras llamadas cebadores, una enzima ADN polimerasa resistente a fluctuaciones de temperatura, un amortiguador apropiado y un equipo llamado termociclador que tiene la capacidad de cambiar las temperaturas dependiendo del ciclaje programado. La PCR consiste de tres pasos principales: el primero es la desnaturalización y sirve para separar mediante temperatura (94ºC) la molécula doble de ADN a cadenas sencillas, que servirán como molde para la síntesis del (o los) fragmento respectivo. En el segundo paso, la temperatura se reduce para el alineamiento(o reconocimiento) de las moléculas iniciadoras a la secuencia blanco del ADN

molde. En el tercero, se lleva a cabo el alargamiento o extensión de la molécula iniciadora mediante la enzima ADN polimerasa a 72ºC. Estos 3 pasos (ciclos) se repiten en el termociclador, permitiendo obtener de manera exponencial el fragmento o los fragmentos discretos sintetizados a partir del molde de ADN (Valadez y Kahl, 2000). La técnica de PCR puede ser aplicada, incluso, a ADNs complejos como es el caso del genómico. Las pequeñas muestras del ADN duplicado (fragmentos) pueden compararse directamente por su polimorfismo al separarlas en geles de agarosa y teñirlas con bromuro de etidio. Existen muchas metodologías basadas en la PCR que se utilizan para diferentes propósito. v Tecnología de la PCR con iniciadores arbitrarios (APT).

La amplificación de la secuencia blanco (amplicón) necesita dos oligonucleótidos iniciadores, cada uno de los cuales es específicamente diseñado para reconocer únicamente a la secuencia complementaria en el extremo 5’ de la cadena de ADN. Este absoluto requerimiento para la sepecificidad de la secuencia había limitado el uso de la PCR. Sin embargo, desde 1990 se desarrolló una nueva tecnología que considera múltiples secuencias blanco, sitios anónimos en el genoma y usa iniciadores de secuencias aleatorias. Esta tecnología con iniciadores aleatorios denominada APT (Arbitrary Primer Technology) consiste de tres modalidades diferentes, pero a la vez similares y ha sido ampliamente aplicada a problemas biológicos para resolver taxonomía o mejoramiento molecular (Valadez y Kahl, 2000). Ø Amplificación aleatoria de marcadores del ADN polimórfico (RAPD). Existen marcadores que presentan ciertas limitaciones en el sentido de que se requiere, al menos, una mínima cantidad de datos acerca de la secuencia genómica del loci de interés, que permita el diseño de los iniciadores apropiados. Estas limitaciones se han superado con el uso de iniciadores de tipo aleatorio en la PCR, que se utilizan en la metodología llamada Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), que permite la síntesis de diferentes fragmentos pequeños del ADN (Valadez y Kahl, 2000). La modificación de la técnica básica de PCR que permite que se produzcan los RAPDs , es muy simple. En lugar de usar un par de cebadores cuidadosamente designados para amplificar una secuencia determinada, se utiliza un único cebador corto, el cual se une a muchos loci. Teóricamente, el número de fragmentos amplificados depende de la longitud del cebador y del tamaño del genoma blanco, y está basado en la probabilidad de que una secuencia de ADN complementaria a la del cebador esté presente en el genoma, en cadenas opuestas del ADN, en orientación opuesta y en una distancia que sea realmente amplificable por la polimerasa. Los cebadores son de secuencia aleatoria generalmente, con un contenido de al menos un 50% de Gs y Cs y carecen de repeticiones internas invertidas. Los productos son separados fácilmente por técnicas de electroforesis estandars y visualizados por iluminación con luz ultravioleta de los geles teñidos con bromuro de etidio (Waugh y Powell, 1992). Este procedimiento es relativamente rápido, puesto que solamente se utilizan pequeñas cantidades de ácido nucleico y no involucra transferencia tipo Southern, ni el uso de radioactividad (Valadez y Kalh, 2000; Waugh y Powell, 1992). Usualmente esta técnica provee marcadores dominantes, ya que los polimorfismos se detectan mediante la presencia o ausencia de bandas que resultan de inserciones o deleciones en las regiones amplificadas, o a partir de cambios de base en el ADN que alteran la unión del iniciador(Valadez y Kalh, 2000; Waugh y Powell, 1992). Entre sus características está su omnipresencia, su naturale za dominante, que presentan herencia mendeliana simple, que detectan un nivel de polimorfismo alto aunque no variantes alélicas. Son capaces de detectar de 1-10 loci. Están presentes en todos los tejidos. El nivel de dificultad técnico es bajo y su confiabilidad es de intermedia a alta (aunque existe un gran debate acerca de esto). La calidad de ADN que requieren es baja (bruto) y la cantidad necesaria de 10-50ng. No utilizan radioisótopos (Waugh y Powell, 1992).

Mientras los RAPDs pueden ser explotados como marcadores que segregan en una forma mendeliana, la identificación de genes útiles ligados usando esta técnica, es un proceso laborioso y consumidor de tiempo. La combinación del uso de los RAPDs y las líneas isogénicas cercanas (NILs) provee de una ruta para la identificación rápida de marcadores ligados a caracteres de interés. Los NILs son generadas por retrocruces repetidos con selección para el carácter deseado en cada ronda de cruzamiento. Este procedimiento resulta en la producción de genotipos que son esencialmente idénticos en todos los loci con excepción de la región que rodea el gen bajo selección. La alta probabilidad de que cualquier polimorfismo generado esté en el ADN que rodea al gen introducido, provee de un medio poderoso para identificar marcadores ligados al caracter de interés (Waugh y Powell, 1992). El uso combinado de los RAPDs con un análisis de segregación múltiple (BSA), ha probado ser una estrategia altamente eficiente para la identificación de marcadores moleculares ligados a genes que controlan caracteres de interés (Moretzsohn y colaboradores, 2000). Actualmente los marcadores tipo RAPDs proporcionan un método rápido para generar mapas genéticos y analizar poblaciones. Además, este tipo de metodología puede dirigirse a la búsqueda de regiones monomórficas por marcadores previamente caracterizados y a la captura de regiones o de genes específicos. También pueden hacer una contribución significativa a la eficiencia de los programas de hibridación somática a través de la identificación de híbridos somáticos en estados tempranos del proceso de regeneración (Waugh y Powell, 1992). Los datos derivados de los RAPDs tienen su fuerte en la distinción entre individuos, cultivares o accesiones, aunque la dificultad de obtener perfiles confiables hace su credibilidad para la modelación questionable. La presencia o ausencia de bandas puede anotarse y convertir los datos en matrices de similitud para el cálculo de distancias genéticas. Al utilizar esta técnica debe tenerse en cuenta que: (a) los marcadores son dominantes por lo que los heterocigotos no pueden ser detectados; (b) en la ausencia de un análisis de pedigree, la identidad de las bandas individuales en los perfiles multibandas no es conocida y puede haber incertidumbres en la asignación de los marcadores a loci específicos; (c) la presencia de una banda de aparentemente igual peso molecular en diferentes individuos no puede ser tomada como evidencia de que los dos individuos comparten el mismo fragmento homólogo, aunque esto normalmente se hace; y (d) bandas únicas en el gel pueden estar comprendidas, algunas veces, de varios productos de amplificación co-migrantes (Karp y colaboradores, 1996). Esta técnica tiene un valor potencial para la caracterización de germoplasma y la identificación de cultivares, como lo demuestra su uso exitoso dentro del género Musa (Crouch y colaboradores, 1998). Además ha contribuido, junto a otros marcadores, al desarrollo de un mapa de ligamiento molecular para este género. Dentro de esta misma línea, en Citrus, ha sido utilizada para mapeo e identificación de cultivares (Deqiu y colaboradores, 1998), al igual que en papaya, donde fue utilizada para construir un mapa de ligamiento para su uso en análisis de loci de caracteres cuantitativos (QTLs). Fueron escrineados los cultivares Sunrise y C356, detectándose 96 polimorfismos que fueron mapeados en la generación F2 de estos cruces (Sondur y colaboradores, 1994). También ha permitido la caracterización de accesiones de uva, llegando a la identificación de todas las variedades analizadas y a una correspondencia con los resultados obtenidos por SSR en estas mismas variedades, e incluso a un nivel mayor que esta última ya que también detectó la variedad intravarietal (Ulanowsky y colaboradores, 2000). Esta correspondencia de resultados también la comparte con los inter-SSR, permitiendo la diferenciación clonal de más de 1200 vides (Regner y colaboradores, 2000). Otro ejemplo es en la caracterización de la diversidad genética en la palma aceitera, donde Moretzsohn y colaboradores (2000) detectaron un bajo nivel de polimorfismo debido a la ya conocida base genética estrecha de esta especie. La información obtenida permitió la construcción de mapas de ligamiento en Elaeis que resultaron ser especie -específicos. Está además, el análisis

de ecotipos locales de coco tanto en Tanzania como en Filipinas (Rohde y colaboradores, 1999),donde solo 8 cebadores RAPD revelaron 15 marcadores polimórficos, los cuales fueron suficientes para distinguir entre los ecotipos filipinos. Una reevaluación de esta técnica por ISTR confirmó los agrupamientos obtenidos por RAPD. Otro de sus usos es en el análisis de relaciones filogenéticas, como por ejemplo, dentro del género Citrus, donde permitió diferenciar entre las especies originadas aparentemente por la vía de la hibridación (las cuales mostraron altos niveles de heterocigosidad) con las que probablemente no surgieron por esta vía (Deqiu y colaboradores, 1998). Es de destacar que estos resultados se corresponden, en su gran mayoría, con los obtenidos por la tan confiable técnica RFLP. Dentro de las aplicaciones de esta técnica está la posible identificación de marcadores ligados a genes de interés. Tal es el caso de 2 marcadores ligados al gen Sh + del engrosamiento de la corteza del fruto en Elaeis guineensis Jacq. (palma aceitera), demostrando la existencia de un gen principal que controla el tipo de fruto en esta especie (Moretzsohn y colaboradores, 2000). Estos marcadores fueron obtenidos por la técnica RAPD. También para la determinación del sexo en papaya (Carica papaya)(Somsri, 1999). Los RAPD pueden intervenir también en la determinación de supuestos híbridos. Con esta temática está el estudio de Magdalita y colaboradores (1997) para probar el hibridismo de 120 supuestos híbridos intraespecíficos de Carica papaya x C.cauliflora Jacq. Los marcadores generados por la PCR usando cebadores RAPD revelaron un alto grado de polimorfismo entre C.papaya y C.cauliflora. De 1-5 cebadores confirmaron confiablemente que las 120 plantas son híbridos genéticos, los cuales contienen al menos una banda del parental macho. Pueden ser útiles también en la identificación de los cultivares por su origen geográfico y por el tipo de embrión, como es el caso del mango (Mangifera indica L.), donde un análisis de agrupamiento de 15 cultivares de esta especie produjo 4 bifurcaciones principales que separaron correctamente los genotipos en 4 grupos de acuerdo a su origen geográfico. Además se detectó un marcador RAPD específico para la poliembrionía (Lopéz-Valenzuela y colaboradores, 1997) De sus resultados se pueden hacer inferencias sobre el origen genético de ciertas espacies, por ejemplo, el de mango. Ravishnkar y colaboradores (2000) seleccionaron 18 cultivares comerciales de mango representativos de los 4 puntos cardinales de la India, con el objetivo de determinar las relaciones genéticas entre ellos. Del análisis de los resultados se desprende que la mayoría de los cultivares de mango se originaron de un pool de genes y fueron domesticados posteriormente. Dentro de la familia Myrtaceae, una de las especies tratadas con marcadores moleculares ha sido Feijoa sellowiana. Dettori y Palombi (2000) utilizaron marcadores RAPDs para identificar accesiones de esta especie y con el objetivo, además, de conocer la variabilidad disponible dentro de éstas. Como resultado, se obtuvieron 23 patrones de bandas, de los cuales 21 caracterizaron una única accesión.

La distribución de las accesiones dentro del agrupamiento no tuvo una relación aparente con el origen geográfico. Esto, unido al bajo número de bandas raras obtenidas, sugiere que la mayoría del material vegetal analizado comparte un ancestro genético común. No siempre es exitoso el uso de estos marcadores. Por ejemplo, Schnell y colaboradores(2001) los utilizaron para determinar parentesco entre plantas de mango procedentes de semilla de las variedades Keitt y Kent. El número de loci no-segregantes en los cultivares parentales fue sorprendente alto, lo cual fue inesperado ya que el mango es considerado generalmente como altamente polimórfico. Se encontraron además, bandas amplificadas en la progenie que no estaban presentes en ninguno de los parentales. Estas complicaciones hacen que los marcadores RAPDs sean menos deseables para este tipo de análisis que otros marcadores moleculares de ADN en mango. Otro caso es sobre su uso en la clasificación de germoplasma y la identificación clonal de Mangifera, donde al analizar los cebadores RAPDs individualmente no produjeron patrones de bandas únicos par los individuos bajo estudio y solo al tomar en cuenta los datos para cada cebador

en pareja, algunos de ellos mostraron patrones únicos que permitieron identificar los cultivares analizados (Schnell y colaboradores, 1995).

Ø Amplificación de huellas del ADN (DAF). Una técnica muy similar, aunque no idéntica para identificar polimorfismos genómicos es la técnica de DAF (DNA Amplification Fingerprinting). Este método se caracteriza por que en la PCR se utilizan moléculas iniciadoras pequeñas (5-15 nucleótidos) pero a concentraciones altas (de 3-30µM), respecto a las otras metodologías reportadas en donde la concentración es de alrededor de 0.3-3µM. La concentración de ADN molde es muy baja (alrededor de 2ng por reacción), así como la temperatura de alineamiento (para permitir la unión no perfectamente homóloga al sitio blanco) (Valadez y Kahl, 2000). Los productos de amplificación son analizados por electroforesis en geles de poliacrilamida y son detectados por tinción sensitiva con plata. La alta resolución del gel de poliacrilamida y la alta sensibilidad de la tinción con plata, producen más bandas que la técnica RAPD y, dependiendo de la especie, permite detectar más polimorfismos. Un ejemplo del uso de esta técnica en los frutales tropicales es en la determinación del sexo de papaya. Se compararon los resultados obtenidos por RAPD como por DAF. Esta última produjp, al menos 5 veces, más bandas que las reacciones RAPD, lo cual permitió un escreening más eficiente; además de que parece ser una técnica más confiable. Con la utilización de un análisis de segregación múltiple, se definieron un gran número de marcadores DAF que estaban presentes solamente en pooles de ADN macho o hermafrodita. Un análisis preliminar para asociaciones de ligamiento indicó que estos marcadores estaban estrechamente ligados a los alelos determinantes del sexo (Somsri, 1999). Ø PCR iniciada con mirosatélites (MP-PCR). La técnica MP-PCR (Micrsatellite Primer-PCR) involucra iniciadores de secuencias complementarias a microsatélites específicos, además de los reactantes necesarios para la PCR mencionados anteriormente. Los productos obtenidos son utilizados también para la diferenciación de individuos. El esquema general se muestra en la figura 12 (Valadez y Kahl, 2000). Para el caso del cultivo del garbanzo, los patrones generados por MP-PCR son muy estables y altamente reproducibles, pero muestran pocos polimorfismos con respecto a las huellas generadas con microsatélites como sondas. Dado que la información de los patrones depende fuertemente de las especies y del iniciador, la técnica debe considerarse como un método complementario a la técnica RAPD. Ø PCR iniciada con microsatélites anclados (AMP-PCR). Esta técnica es una variante derivada de MP-PCR que emplea iniciadores con anclas en sus extremos 3’ ó 5’. Esta clase de iniciadores consiste de una, dos o tres bases adicionales al microsatélite y sirven para seleccionar aquellas islas de microsatélites en el genoma que están flanqueados con el complemento de bases específicas; por lo que se incrementa su especificidad. Generalmente la técnica AMP-PCR (Anchored Microsatellite Primer-PCR) es más eficiente que la de MP-PCR o RAPDs, ya que ha demostrado detectar más variabilidad genética, específicamente si sus productos son separados en geles de poliacrilamida de alta resolución. La cantidad de secuencias iniciadoras de AMP disponibles son potencialmente altas, de manera que es posible hacer uso de ellas para análisis de genomas.

El número de productos amplificados esperados depende de la longitud y tipo del iniciador con ancla; así como del bajo número de amplicones y viceversa. El uso de un ancla de secuencia degenerada, es decir, con una secuencia de bases nitrogenadas no del todo complementaria, generalmente incrementa la complejidad de los patrones de bandeado. Los patrones de bandeado de AMP -PCR son muy estables y reproducibles y exhiben más polimorfismo que los obtenidos con MP-PCR. Al igual que RAPDs y MP -PCR, la técnica de AMP-PCR pertenece a las técnicas para caracterización de genomas, que generan información valiosa acerca de la estructura de éstos- y asisten para la generación de marcadores genéticos dominantes- que pueden ser empleados exitosamente para detectar polimorfismos en la diversidad genética, taxono mía molecular y estudios filogenéticos moleculares (Valadez y Kahl, 2000). Ø Polimorfismo de marcadores de secuencias específicas vecinas a microsatélites (STMS).

Los STMS (Sequence-Tagged Microsatellite Site), llamados marcadores de segunda generación, permiten definir la identidad entre dos bandas iguales y la discriminación entre un estado homo u heterocigoto de un posible locus. Este tipo de marcadores puede abarcar tanto la especificidad de alelos como la de microsatélites que se generan mediante la amplificación específica de un locus, donde está presente un microsatélite particular. El desarrollo de marcadores STMS es demasiado costoso y laborioso por la serie de pasos que lleva (Valadez y Kahl, 2000). Secuencia de eventos para la obtención de secuencias específicas vecinas de microsatélites para la obtención de alelos marcadores: 1. Establecimiento de una biblioteca genómica de longitud específica. El ADN genómico de las plantas se aísla primeramente y se corta con dos enzimas de restricción. Los fragmentos resultantes se separan con electroforesis y se seleccionan aquellos que tengan una longitud entre 200-800 pb. Todos los fragmentos de este tamaño se clonan en un vector plasmídico y se transforma a E.coli con ellos. En esta forma queda establecida la biblioteca genómica, cuyas longitudes de insertos van de 0.2-0.8 kb. 2. Aislamiento de clones que contienen microsatélites a partir de la biblioteca establecida.

La biblioteca es sembrada en placas Petri. Una vez que se forman las colonias bacterianas se transfiere parte de las bacterias de cada colonia a una membrana de nailon. Las colonias transferidas se lisan, se desnaturaliza el ADN y se hibridan con una sonda de microsatélite marcada (en este caso (AT)n). Las colonias que contienen AT son detectadas por autorradiografía por rayos X. 3. Diseño de iniciadores flanqueantes de regiones microsatélites. Los clones positivos se crecen en medio líquido, se purifica el ADN plasmídico y los insertos son removidos y secuenciados. Usando un programa de computadora, se diseñan los iniciadores de alrededor de 20 pb a partir de las regiones flanqueantes de los microsatélites. Estos iniciadores permitirán posteriormente la amplificación de alelos específicos de microsatélites, ya que el iniciador se unió a sitios que son únicos.

4. Detección de polimorfismos alélicos en diferentes individuos.

Los alelos se visualizan mediante tinción con plata, autorradiografía o fluorescencia con bromuro de etidio después de la respectiva electroforesis de geles de poliacrilamida de alta resolución. Estos procedimientos extravagantes, permiten producir pares de iniciadores que amplifican específicamente microsatélites individuales. La separación de los amplicones después de la amplificación en geles de poliacrilamida de alta resolución detectan solo una banda (estado homocigoto) o dos bandas (estado heterocigoto). Las principales ventajas que ofrecen los marcadores STMS son: (a) Su manifestación codominante y específica de locus. Los diferentes alelos difieren uno del

otro en el número de secuencias de microsatélites, creando un número variable de polimorfismos de repeticiones seriadas (VNTR).

(b) Su alto contenido de información, por ejemplo el número y frecuencia de alelos detectados (Fig 21).

(c) La relativa facilidad de su detección. Comparativamente se requieren pocos materiales biológicos, es una técnica rápida, sensible y el ADN parcialmente degradado es tolerable por la PCR para hacer la reacción.

Entre sus principales desventajas están: (a) El costo de producción es extremadamente alto. (b) Su especificidad. La generación de marcadores STMS para una especie puede normalmente no

ser transferido a otra especie relacionada, incluso a especies cercanamente relacionadas. Ø Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLP) Los AFLPs son fragmentos de DNA que proceden de la restricción del DNA genómico digerido y son amplificados usando cebadores dirigidos (Matthes y colaboradores, 1998; Karp y colaboradores, 1997; Vos y colaboradores, 1995). Vos y colaboradores (1995) argumentaron que la confiabilidad de la técnica RFLP está combinada con el poder de la técnica de PCR. Powell y colaboradores (1996) sugirieron que los AFLPs proporcionan altos niveles de resolución para permitir un bosquejo de estructuras genéticas complejas.

Su basamento consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción y ligando posteriormente adaptadores de doble cadena (de 25 a 30 pb a cada lado del fragmento de restricción y con una pequeña cola 5’) (Valadez y Kahl, 2000) al extremo final de los fragmentos de DNA generados, con el objetivo de obtener un DNA modelo para la amplificación. La secuencia de los adaptadores y el sitio de restricción adyacente sirven como sitios de unión al cebador para poder lograr la amplificación.

La designación del cebador AFLP está principalmente determinada por la designación de los adaptadores, los cuales están ligados a los fragmentos de restricción. Una característica importante de estos cebadores es que todos comienzan con un residuo de guanina (G) en el extremo 5’. Se ha encontrado que este residuo en los cebadores no marcados es crucial para prevenir el fenómeno de doble banda. La selectividad del cebador es relativa y también depende del número de fragmentos amplificados en una sola reacción, las condiciones de la PCR y la de signación del cebador. Siempre puede ocurrir cierto nivel de amplificación errada, pero las condiciones de la reacción pueden prevenir que estas bandas erradas lleguen al nivel de detección (Vos y colaboradores, 1995). Al extremo 3’ de los cebadores se le incluirán nucleótidos selectivos, con el objetivo de promover solamente la síntesis de DNA de un subgrupo de sitios de restricción. Por tanto, solo los fragmentos de restricción, cuyos nucleótidos que flanquean el sitio de restricción enlazan con los nucle ótidos

selectivos, serán amplificados(Fig 22)(Vos y colaboradores, 1995). El uso de nucleótidos selectivos es importante ya que si todos los fargmentos Mse I-EcoRI se amplificaran, el número de productos podría ser muy grande y los patrones de bandas sería n muy complejos (Valadez y Kahl, 2000). Los fragmentos de restricción para la amplificación son generados por 2 enzimas de restricción (una cortadora frecuente y una rara), lo cual resulta en una amplificación predominante de aquellos fragmentos que tengan una secuencia cortadora rara en un extremo y una secuencia cortadora frecuente en el otro (Vos y colaboradores, 1995; Valdez y Kahl, 2000). Entre las enzimas cortadoras frecuentes más utilizadas está la Mse I, debido a que como la mayoría de los DNAs eucarióticos son ricos en AT y la secuencia de reconocimiento de esta enzima es TTAA, corta muy frecuentemente, rindiendo fragmentos que están en el rango de tamaño óptimo tanto para la amplificación de la PCR como para la separación en los geles desnaturalizantes de poliacrilamida. Otras enzimas raras trabajan igual que la EcoRI. Sin embargo, esta es preferida debido a que es confiable y de bajo costo, lo cual limita los problemas asociados con una restricción parcial (Vos y colaboradores, 1995). Una restricción incompleta del DNA cusará problemas en los patrones de bandas, debido a que se pueden generar fragmentos parciales, los cuales serán detectados por el procedimiento AFLP. Cuando se comparan varias muestras de DNA por AFLP, una restricción incompleta resultará en la detección de diferencias en los patrones de bandas, lo cual no refleja un verdadero polimorfismo. Las razones para el uso de 2 enzimas de restricción son las siguientes: (i) la cortadora frecuente generará fragmentos de DNA pequeños, los cuales amplificarán bien y están en el rango de tamaño óptimo para la separación en geles desnaturalizantes; (ii) el número de fragmentos para ser amplificados está reducido usando la cortadora rara, ya que solo los fragmentos cortadora rara/cortadora frecuente se amplificarán; (iii) el uso de 2 enzimas hace posible el marcaje de una de las cadenas de los productos de doble cadena de PCR, lo cual previene la aparición de dobletes en el gel debido a una mobilidad desigual de las 2 cadenas de los fragmentos amplificados; (iv) el uso de las 2 enzimas brinda la mayor flexibilidad en la sincronización del número de fragmentos a ser amplificados y (v) pueden generarse un gran número de huellas de DNA usando varias combinaciones de un número bajo de cebadores (Vos y colaboradores, 1995). Experimentos con DNA de plantas (Arabidopsis sp, tomate y maíz) y en humanos han mostrado la necesidad de una estrategia de amplificación en 2 pasos (Fig 22). El primero es llamado de preamplificación y en este el DNA genómico es amp lificado con cebadores que tienen un solo nucleótido selectivo. Este producto de PCR es diluído y utilizado como modelo para una segunda reacción usando cebadores con 3 bases selectivas (Valadez y Kahl, 2000).Esta estrategia reduce el smear en los patrones de huellas de DNA y además provee de una cantidad virtualmente ilimitada de DNA modelo para las reacciones AFLP (Vos y colaboradores, 1995). Normalmente uno de los dos iniciadores de AFLP se marca radioactivamente y los fragmentos amplificados pueden ser detectados después de su separación en geles de secuenciación de alta resolución con autorradiografía (Valadez y Kahl, 2000). Una característica a resaltar en la reacción de AFLP es que el cebador marcado es consumido completamente casi siempre (el no marcado está en exceso) y por tanto la reacción de amplificación se detiene cuando éste se acaba. Se ha comprobado que ciclos térmicos adicionales no afectan el patrón de bandas una vez que es consumido el cebador marcado. Esta característica es elegantemente utilizada en el protocolo de AFLP, para el cual un exceso de ciclos de PCR resulta en patrones de igual intensidad no obstante las variaciones en la concentración del templado. A su vez estos patrones tienden a no ser confiables por debajo de determinada concentración (aproximadamente 1pg), sin considerar la complejidad del DNA. La correlación casi linear entre el número de fragmentos amplificados y el tamaño del genoma se pierde en el genoma complejo de las plantas superiores, el cual contiene un alto número de secuencias repetidas y, por tanto, de fragmentos de restricción multicopia. Los patrones de bandas

de estos DNAs consisten predominantemente de fragmentos AFLP únicos, pero están caracterizados por la presencia de un número pequeño de fragmentos repetidos más intensos (Vos y colaboradores, 1995). El uso de los marcadores AFLP para el mapeo genómico puede enlazar la brecha que existe entre los mapas físicos y los genéticos (Vos y colaboradores, 1995). Desde que se consideró esta hipótesis, muchas investigaciones han aplicado esta técnica a estudios de mapeo (Xu y colaboradores, 1999). Xu y colaboradores (1999) sugirieron que el uso de los AFLPs es la forma más eficiente de generar un gran número de marcadores ligados a genes blanco. Sin embargo, el alto polimorfismo revelado por estos marcadores ha interesado a investigadores de otros campos; por lo que su uso se ha ampliado a la genética de las poblaciones, análisis de filogenia e identificación cultivar/accesión. La ventaja principal que tienen es el gran número de polimorfismo que generan. Por ejemplo, Barker y colaboradores (1999) encontraron mayor cantidad de bandas polimórficas usando una cantidad mucho menor de cebadores AFLP comparado con los RAPD , en un estudio de diversidad genética en Salicaceae. Por otra parte, Nakajima y colaboradores(1998) encontraron que el método AFLP produjo un promedio de 4 veces muchas más bandas por reacción comparado con los RAPD en un análisis de diversidad de Apicaceae. Similarmente, Maughan y colaboradores (1998) encontraron que los AFLPs produjeron muchos más loci polimórficos por cebador que los RFLPs, SSRs ó RAPDs en un estudio de diversidad de la soja (Leguminoseae). Otras características ventajosas son: no se requiere ninguna información sobre la secuencia analizada; la técnica de PCR es rápida y es posible una relación multíciple alta (Rafalski y colaboradores, 1996). Esta característica de no necesitar una información previa de la secuencia analizada es compartida con los RAPDs, contrario a los RFLPs y los SSRs que necesitan un alto grado de caracterización del genoma en estudio. La relación multíciple es el número de loci genéticos diferentes que pueden ser analizados simultáneamente por experimento (Rafalski y colaboradores, 1996). Debido a que los marcadores AFLPs están distribuídos en todo el genoma, ellos tienen esta relación alta, o sea, cada banda es asumida como que proviene de un área diferente del genoma de la planta. En contraste, los SSRs tienen un gran número de alelos por locus y por tanto su relación es igual a 1 (Harris, 1999). Se considera más apropiado tener una relación alta, ya que esto sugiere que está siendo muestreado todo el genoma en vez de un segmento de este. Krauss y Peakall (1998) sugieren que después del período de escreening inicial, pudieran ser analizados 100 individuos por cada 100 loci polimórficos por semana, lo cual hace que esta técnica sea ideal para estudios poblacionales a gran escala. Además, se puede utilizar material seco para el análisis, debido a que el método es basado en el DNA. Esto permite el análisis de especies que pudieran ser difíciles de colectar ex situ. Los problemas asociados con esta técnica pueden dividirse en tres tipos: prácticos (a), de datos (b) y de análisis (c). Muchos de estos problemas no son únicos para los AFLPs, sino que se aplican a la mayoría de los sistemas de marcadores moleculares. (a) Muchos de estos problemas, a diferencia de los que se presentan con los RAPDs, pueden ser

superados, aunque los manipuladores deben ser expertos en muchas habilidades prácticas. .1 Costo. Este parámetro depende del punto de vista del intreresado y de la cantidad de recursos de que éste dispone. Por ejemplo, los RAPDs son bastante baratos pero en término de calidad de los datos se requiere de bastante dinero. Existen varios componentes caros en el AFLP: las sondas biotiniladas y las bolitas magnéticas de estreptovidina, los cebadores y los adaptadores, el sistema de detección (Huang y Sun, 1999).

.2 Enzimas. La elección de cuál enzima o cebador utilizar puede afectar el número de polimorfismos AFLPs detectados. Por ejemplo, para el caso de las enzimas, se detectó mayor polimorfismo con la combinación Pst I / Mse I que con EcoR1 / Mse I en cebada (Ridout y Domini, 1999). Para el uso de los cebadores por ejemplo, Hart y Seefelder (1998) evaluaron 60 combinaciones de estos y solo 8 de éstas proporcionaron patrones de bandas confiables. En otros casos se pueden presentar patrones más densos que hacen imposible un conteo confiable. Así, la selección del cebador puede influir en el número de bandas amplificadas y el nivel de polimorfismo encontrado. En general, el genoma de las plantas es rico en A-T, por lo que el uso de cebadores pobres en A-T puede reducir la complejidad del patrón de bandas (Qi y Lindhout, 1997). Si no se realiza un escreening preliminar de las combinaciones de cebadores, entonces la selección del cebador es esencialmente aleatoria y existe por tanto el riesgo de que brinden datos insuficientes para el análisis. A menudo el costo de la técnica AFLP es tal, que solo se puede analizar un número limitado de combinaciones de cebadores. .3 Reproducibilidad. Los AFLPs son proclamados generalmente por esta característica, lo cual sitúa a la técnica aparte de los RAPDs. Esto fue probado en una red de laboratorios europeos a través de un control riguroso de todas las variables que fueran capaces de mostrar que es posible reproducir un patrón de bandas AFLP. Otro aspecto de la reproducibilidad es la consistencia de la reacción, o sea, si una accesión y una combinación de cebadores brinda el mismo resultado siempre. Winfield y colaboradores (1998) corrieron muestras duplicadas de 5 árboles, obteniendo el mismo patrón de bandas para 3 de los duplicados y para los otros 2 un porciento de similitud mayor del 95% en un estudio de diversidad genética del álamo negro (Populus nigra subsp.betulifolia). La digestión parcial puede ser otro factor que afecte la reproducubilidad y parece ser la fuente más común de falso polimorfismo en los análisis de AFLP (Lin y Kuo, 1995) y puede ser causada por un número de factores que incluyen la contaminación o la metilación del DNA (Dowling y colaboradores, 1997). El conteo de los fragmentos AFLP, como el de los RAPDs, está sujeto a la interpretación dada por cada investigador. Hay quienes detectan todas las bandas mono y polimórficas a ojo (Travis y colaboradores, 1996). Otros utilizan detección fluorescente, considerando sólo los picos de alta intensidad (Escaravage y colaboradores, 1998). También están los que incluyen solamente los fragmentos distintivos, reproducibles y bien separados (Aggarwal y colaboradores, 1999). Lo que es interesante destacar es que en ningún artículo se define lo que constituye una banda distintiva, reproducible y bien separada; por lo que cada investigador lo hace desde su punto de vista, lo cual también afecta la reproducibilidad cuando se comparan trabajos similares realizados por diferentes personas. Referente a esto, Krauss y Peakall (1998) sugirieron que la detección por computadora (Como parte del método de detección fluorescente) de los fragmentos es más eficiente y exacta que el conteo de bandas por autorradiogramas. (b) .1 Dominancia. Como los marcadores RAPDs, los AFLPs son dominantes, con detección de polimorfismo por la presencia/ausencia de la banda. Los marcadores dominantes no son tan eficientes como los codominantes para los estudios de la genética poblacional (Lynch y Milligan, 1994). Lynch y Milligan (1994) estimaron que se necesitan de 2-10 veces más individuos muestreados por locus para los marcadores dominantes que para los codominantes. Krauss y Peakall (1998) sugirieron que esta desventaja puede ser salvada debido al gran número de polimorfismos que se generan (cerca de 100 polimorfismos por línea).

Se ha sugerido que es posible identificar a los heterocigotos a partir de la intensidad de las bandas o los picos en los geles de AFLP (Castiglioni y colaboradores, 1999). Esto es, un heterocigoto para un marcador tendrá una banda la mitad de densa del homocigoto para el alelo dominante, basado en la idea de que habrá 2 veces más marcadores para el homocigoto dominante comparado con el heterocigoto. Sin embargo, Vos y colaboradores (1995) demostraron que el procedimiento AFLP es insensible a la concentración de DNA templado, ya que se observó una intensidad de bandas similar en un rango de concentraciones analizadas del templado (25ng-25pg). .2 Homología. La homología es quizás el mayor problema en el análisis AFLP. Se asume a menudo que 2 bandas co-migrantes son homólogas, aunque no existe una razón a priori para aceptarlo. Kardolous y colaboradores (1998) argumentaron que la posibilidad de que 2 fragmentos AFLP co-migrantes no representen alelos idénticos de un mismo locus es pequeña, lo cual ellos pensaban que se debía a la amplificación altamente selectiva y a la ayuda de la resolución de los geles de poliacrilamida. Rieseberg (1996) sugirió que la homología RAPD es función de la distancia taxonómica, o sea, mientras más estrechamente relacionadas estén las accesiones comparadas, es mayor la probabilidad de que sea homóloga una banda co-migrante compartida. Esto también se puede extender al análisis de los AFLPs, debido a que Lercetau y Szmidt (1999) encontraron que los AFLPs reflejaron la taxonomía clásica de Pinus a niveles taxonómicos bajos, pero en los más altos los grupos de datos fueron incongruentes. Un punto de vista conservador pudiera ser que por encima del nivel de especie, el uso de los AFLPs para la clasificación y las filogenies no ofrece garantías. .3 Conteo. Las mutaciones son contadas como presencia o ausencia de una banda y por tanto, las diferencias en los patrones son debido a la presencia o ausencia del sitio de restricción. Existen, por tanto, 3 cambios básicos en el perfil: la ganancia o la pérdida de una banda y el cambio en el tamaño de la banda. No todos estos cambios son igualmente probables, por lo que ocurren a diferentes frecuencias. La pérdida de un sitio de restricción es probablemente causada por una mutación puntual en la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción, provocando que ésta no sea reconocida por la enzima y por tanto no se corte. Asimismo, la ganancia de un sitio es causada por una mutación puntual que cambia un sitio potencial en un sitio reconocible. Las probabilidades de estos 2 eventos son diferentes, siendo la pérdida del sitio de restricción mucho más probable que la ganancia. La pérdida o la ganancia de sitios puede ser producida también por eventos de inserción, deleción o duplicación, además de cambios en el tamaño de la banda que pueden ser malinterpretados como ganancia o pérdida de un sitio de restricción o de una banda. A menos que sean investigadas las razones para todos estos cambios entre todos los taxas, serán contados dobles varios cambios en la matriz de datos. El nivel de ploidía del taxa bajo investigación puede afectar la cantidad de variación observada. Kardolus y colaboradores (1998) registraron el número de bandas polimórficas en cada nivel de plodía (di, tetra y hexaploides) en Solanum, el cual fue diferente para cada uno. Las bandas extra, si están correlacionadas con la poliploidía, introducen complicaciones en el conteo para la matriz de datos. Si estas bandas están solo presentes en los poliploides, entonces no pueden ser contadas como ausentes (0) en el diploide (y en el tetraploide existen bandas en el hexaploide), por lo que son anotadas como indeterminadas (¿). La usencia o presencia de bandas en los diploides no puede ser determinada debido a que el fragmento que produce la banda no está presente en el diploide. Esto introduce dificultades cuando se trabaja con diploides y poliploides en el mismo análisis. (b) Una vez que los perfiles AFLP han sido convertidos en una matriz de datos, pueden ser

analizados de tres formas diferentes: me diciones de similitud, frecuencia y de caracteres. Las 2

primeras convierten la matriz binaria en una serie de medidas de distancia entre los taxa. El tercero utiliza los datos como caracteres en un análisis. La selección entre las medidas de similitud o frecuencia depende primariamente del número de accesiones analizadas y el objetivo de la investigación. Hay tendencia a utilizar las medidas de similitud cuando el número de accesiones es pequeño (<50) y el análisis está enfocado en la variación entre indiv iduos (Beisman y colaboradores, 1997; Escaravage y colaboradores, 1998), mientras que para estudios con un número mayor de accesiones y con énfasis en la variación entre poblaciones se utilizan generalmente las medidas de frecuencia (Perera y colaboradores, 1998). Los análisis de los datos AFLP basados en caracteres son un método inusual de análisis de los resultados de esta técnica, excepto en los estudios con una hipótesis filogenética explícita (Kardolus y colaboradores, 1998).

.1 Medidas de similitud. Las utilizadas para los datos AFLP son: (i) el coeficiente de unión simple (SMC), el cual mide la proporción de bandas ausentes o presentes compartidas entre 2 perfiles AFLP; (ii) el coeficiente de Jaccard, el cual mide la proporción de bandas compartidas; ó (iii) el coeficiente de Nei y Ly (NL), el cual mide la probabilidad de que una banda amplificada en una muestra sea amplificada en otra. El NL también tiene una perspectiva bilógica, ya que es un estimado de la proporción de bandas compartidas por 2 muestras debido a que estas fueron heredadas de un ancestro común (Harris, 1999). Lamboy (1994) sugirió que pueden ser identificados 2 grupos principales de errores para los datos RAPDs: los falsos positivos (presencia de un producto cuando éste debe estar ausente) y los falsos negativos (ausencia de un producto cuando debe estar presente). Ambos grupos de errores son aplicables a los datos AFLP, aunque a un nivel menor debido a lo estricto de la reacción de la PCR en el AFLP. La otra fuente de error es la no-homología entre fragmentos co-migrantes, lo cual puede ser clasificado como falso positivo. Todas estas fuentes de errores introducen un sesgo en los estimados de similitud. 2 Medidas de frecuencia. Como los RAPDs y las aloenzimas, los AFLPs son utilizados para la distribución de la diversidad genética dentro y entre las especies, cultivares y poblaciones. A partir de la frecuencia de los productos AFLP se pueden calcular los niveles y patrones de diversidad. Los marcadores son generalmente tratados como independientes y las diversidades son calculadas usando: (i) medidas de similitud; (ii) medida de Shannon y (iii) análisis de varianza molecular (AMOVA). Las fuentes de error son esencialmente las mismas que para las medidas de similitud, pero con la complicación adicional de la dominancia de las bandas AFLP. Con los loci dominates, la varianza de un único loci se incrementa e introduce un sesgo en la medida de la frecuencia (Lynch y Milligan, 1994), aunque existen métodos para superar este problema (Lynch y Milligan, 1994). .3 Medidas de caracteres. Esto pudiera ser una forma ideal de anlizar los datos AFLP. Los AFLP son anotados fácilmente como una matriz de datos binaria discreta, siendo los caracteres las bandas AFLP y sus estados la presencia o la ausencia. La literatura indica que cambiar este tipo de datos en medidas de similitud o de frecuencia puede ser no deseable (Swofford y colaboradores, 1997), debido a que las medidas de caracteres contienen más información que las medidas de distancia. Swofford y Olsen (1990) sugirieron que para utilizar un dato como carácter, los caracteres deben ser variables, independientes y homólogos. Los AFLPs son variables, pero algunas bandas no son homólogas ni independientes. No existe forma de identificar y remover estas bandas de una matriz de datos. Ambas deficiencias pueden comprometer el análisis. Los datos AFLP, si son usados como caracteres, se analizan por los métodos de parsimonia y de máxima probabilidad. Este último pudiera modelar el proceso que causa la ganancia o la pérdida de

bandas y asigna probabilidades a estos eventos. Se construye entonces el árbol más probable, donde puede ser modelado exactamente el proceso involucrado con el cambio nucleotídico (Page y Holmes, 1998). Tales investigaciones no se han llevado a cabo para los datos AFLP, por lo que el método no está disponible hasta el presente para el análisis de estos datos. Pocos análisis de los datos AFLP han usado parsimonia. Por ejemplo, Kardolous y colaboradores (1998) implementaron la parsimonia de Wagner investigando la sistemática de Solanum; mientras que Angiolitto y colaboradores (1999) implementaron la de Dollo al investigar la diversidad genética en Olea. Swofford y colaboradores(1997) revisaron los diferentes tipos de parsimonia. La primera, una de las más simples, asume la reversibilidad libre de los caracteres, lo cual significa, con 2 caracteres, que la probabilidad de la pérdida y la ganancia de una banda AFLP es la misma. Sin embargo, estos 2 eventos pueden no tener la misma probabilidad. Una alternativa es la segunda parsimonia, la cual permite las reversiones (pérdida de bandas), pero permitirá que la ganancia ocurra una vez en el árbol. Esto es poco realista otra vez, debido a que la probabilidad de una ganancia independiente de una banda no debe ser desatendida. (d) Medidas de distancia y reconstrucción filogenética. El uso de las medidas de distancia para construir un dendograma a partir de los datos AFLP, consta de 2 pasos: (i) la conversión de la matriz de datos binaria a una matriz de distancia y (ii) el uso de la matriz de distancia y un programa constructor de árboles para construir el dendograma. El uso de las matrices de distancia AFLP y la filogenia está centrada en la calidad de los datos que se entran en los programas constructores de árboles. Como se discutió anteriormente, existen muchas posibles causas de error en un análisis AFLP y esto puede causar problemas con el cálculo de las distancias genéticas, lo cual añade un nivel de incertidumbre al dendograma resultante. Se ha encontrado que los métodos basados en las huellas de fragmentos de ADN genómico por cebadores aleatorios son susceptibles a la concentración de ADN molde. Una técnica de huellas de ADN debe ser insensible preferiblemente a las variaciones en la concentración de ADN molde. La técnica AFLP es insensible a la concentración del ADN molde, lo cual fue corroborado por un estudio en el cual se variaron las cantidades de ADN de 2.5pg-25ng y se obtuvo un patrón de bandas similar al resto con la menor concentración (Vos y colaboradores, 1995). La técnica AFLP parece ser tan reproducible como los RFLP, pero necesita una mayor demanda técnica y requieren más ADN (1µg por reacción) que los RAPDs. Comparte muchas de las limitaciones de los RAPDs en lo referente a la homología de bandas y las identidades (Karp y colaboradores, 1996). Esta técnica ha sido aplicada exitosamente en una variedad de sistemas. Un análisis preliminar en poblaciones mejoradas del género musa sugiere que este método puede ser una herramienta poderosa en el mejoramiento molecular del plátano y la banana (Van Gysel, datos no publicados). Los AFLPs han sido utilizados en la identificación de cultivares, como es el caso del genotipaje de más de 1200 vides (Regner y colaboradores, 2000) y el análisis de la diversidad genética en accesiones italianas de uva (Sensi y colaboradores, 1996). Los resultados obtenidos fueron casi idénticos a los revelados por ISTR, aunque esta última detectó más diversidad entre las varias accesiones de uno de los cultivares de uva. Un estudio similar se realizó con 14 poblaciones de coco procedentes de toda el área geográfica. De forma general hubo una buena separación de las poblaciones y las relaciones fenéticas estuvieron en correspondencia con las obtenidas previamente por RFLP, poniendo de manifiesto la confiabilidad de esta técnica. Esta correspondencia de resultados también es compartida con los SSR en un estudio de diversidad genética en las poblaciones de coco de Sri Lanka (Perera y colaboradores, 1998). Otro de sus usos es en el análisis de las relaciones filogenéticas. Por ejemplo, Eiadthong y colaboradores (2000), con este objetivo, analizó 14 especies de Mangifera. Los resultados mostraron que la variación intraespecífica entre los 7 cultivares del mango común fue mucho menor que la interespecífica, e incluso fueron clasificados en un solo grupo. Estos resultados y otros obtenidos implican que el análisis AFLP es una técnica eficiente y confiable para generar datos, ya sea por estudios intra o interespecíficos, en el género Mangifera.

Ø Detección de secuencias polimórficas mediante iniciadores complementarios a

retrotransposones. Una parte considerable de los genomas de eucariontes consiste de ADN repetitivo. La mayoría de esas secuencias son componentes integrales del genoma y pueden ser expandidas o reducidas en tamaño pero nunca cambian su posición. Otro tipo de secuencias redundantes son los transpones o los retrotransposones, que son capaces de moverse de uno a otro locus. Especialmente los retrotransposones son secuencias que ocurren de manera más frecuente y se pueden encontrar prácticamente en todo el genoma, por lo que se les considera buenos candidatos para ser tomados como marcadores moleculares. Retrotransposones. Mientras que un transposón se mueve en el genomas como copias de ADN, los retrotransposones son primeramente transcritos a copias de ARN y posteriormente convertidas a ADNs mediante la transcriptas reversa, incorporándose posteriormente a un nuevo sitio genómico. Dos diferentes clases de retrotransposones pueden ser discernidos: (1) Retrotransposones LTR, que son secuencias flanqueadas por repeticiones terminales largas

(Long Terminal Repeats) similares a los retrovirus. (2) Retrotransposones sin LTR, que no contienen secuencias flanqueantes LTR. Estos elementos

fueron primeramente descritos en genomas de mamíferos, pero obviamente también son componentes de genomas de hongos, de invertebrados y de plantas.

El mecanismo replicativo de la transposición da lugar a un retrotransposón original por todas partes del genoma. Sin embargo, debido a que el paso de la transcripción introduce muchos errores, la mayoría de las copias transpuestas están defectuosas y dan lugar a una transposición inactiva. Por lo tanto, existe una heterogeneidad extrema de retrotransposones dentro de un genoma (Valadez y Kahl, 2000). Los retrotransposones son excelentes herramientas para generar marcadores de ADN polimórfico debido a que ellos:

• Se encuentran de manera ubicua en el reino vegetal. • Están presentes en un alto número de copias en la mayoría de los genomas de las plantas. • Poseen un alto grado en diversidad de secuencias. • Generan polimorfismo (s) mediante inserción que permiten discriminar dentro y entre especies.

- Marcadores basados en retrotransposones.

Esta clase de marcadores permite el estudio de la diversidad genética de individuos y poblaciones. Además pueden ser usados para mapeo genético y clonación de genes de interés agronómicos basado en mapas. Las dos técnicas más relevantes por esta metodología se describen brevemente a continuación, además de una técnica novel basada también en los retrotransposones: 1) Polimorfismos amplificados mediante microsatélites-retrotransposones (REMAP). Es una técnica que combina la ocurrencia frecuente y varia bilidad de microsatélites con la de los retrotransposones. Se utilizan iniciadores complementarios a LTR y a microsatélites, para amplificar regiones genómicas entre dos elementos adyacentes. Los patrones resultantes de la amplificación pueden ser complejos, debido a que ésta también podrá iniciarse desde uno de los microsatélites siguientes y a partir de una secuencia LTR a otra LTR

vecina sin implicar microsatélites. De cualquier manera, todos los productos de amplificación pueden ser polimórficos, por lo que la información del contenido polimórfico procedente del análisis REMAP puede ser alto Valadez y Kahl, 2000). 2) Polimorfismos amplificados entre retrotransposones (IRAP). Esta técnia genera polimorfismos que pueden ser detectados después de la amplificación de la región genómica ubicada entre dos retrotransposones adyacentes. Se utilizan iniciadores complementarios a las secuencias flanqueantes del retrotransposón; uno de los cuales se recomienda esté marcado, con la finalidad de evidenciar más fácilmente los polimorfismos. Las secuencias polimórficas en la región del inter-transposón, generalmente, son causadas por mutaciones (deleciones, inserciones, rearreglos, etc). El nivel de polimorfismo detectado por la técnica IRAP puede ser menor que por REMAP, ya que depende solamente de la cantidad de mutaciones presentes en la región normal (Valadez y Kahl, 2000). 3) Repeticiones de secuencias inversas marcadas (ISTR). El ISTR es una técnica novel basada en la PCR que permite el análisis del genoma en el reino vegetal y animal. Esta técnica surge del estudio del ADN genómico de coco con la enzima EcoRI, el cual mostró unos fragmentos de 1.3-1.4 kb , producto del corte con la enzima. Estos fragmentos más la región espaciadora (región sombreada en la Fig 27 B) fueron secuenciados y revelaron una alta homología con parte del elemento copia BARE-1 de cebada. Basado en la presencia abundante de los elementos copia en el reino vegetal, se examinaron los ADNs de otras especies de plantas, con el objetivo de demostrar la presencia de estos elementos en otros cultivo además del coco. Para esto se diseñaron cebadores a partir de la secuencia ya conocida de estos elementos copia, que fueran capaces de copiar la región entre ellos (de ahí el término de secuencia invertida), que es lo que realmente genera polimorfismo. Los resultados obtenidos mostraron que la secuencia EcoRI de 1.3-1.4 kb completa, puede ser explotada para la síntesis de cebadores ISTR y la generación de ADN polimórfico. Además, estas secuencias copia, independientemente de su longitud, están aparentemente distribuidas entre los genomas eucarióticos tal que, una amplificación de la PCR con dos cebadores ISTR resulta en patrones de huellas de ADN distintos y reproducibles (Fig 28). Estos estudios fueron extendidos al reino animal e incluso a los humanos, obteniéndose resultados satisfactorios pero que precisan de un estudio a escala mayor. Las técnicas ISTR y AFLP utilizan el mismo procedimiento analítico (geles de secuencia). El gran número de loci detectados en un único análisis ISTR conjuntamente con el alto porcentaje de fragmentos polimórficos, se compara favorablemente con la recientemente desarrollada tecnología AFLP. Las ventajas del ISTR sobre el AFLP son 4 fundamentalmente: (i) después del aislamiento del ADN no son necesarias manipulaciones adicionales en el caso del ISTR; (ii) la restricción del ADN genómico por dos enzimas diferentes, la adición catalizada por la T4 ADN ligasa a los adaptadores y la preamplificación como parte del protocolo de la técnica de AFLP, no solo son consumidoras de tiempo, sino que además, en la reacción de ligazón se requiere ADN muy puro, el cual es técnicamente difícil de obtener; (iii) la adición de nucleótidos terminales únicos a los adaptadores/cebadores AFLP para una amplificación de la PCR discriminatoria, invoca a un equipo de PCR confiable y altamente exacto, si se desean obtener resultados reproducibles y (iv) los 3 pasos adicionales (restricción, ligazón y preamplificación) encarecen la técnica AFLP respecto al ISTR (Rohde, 1995). Aunque se necesitan estudios más intensos, la experiencia también sugiere que la reproducibilidad de la técnica es alta, como lo muestra el estudio con 8 preparaciones individuales de ADN (4 con

material idéntico y la otra mitad con diferente material foliar) procedente del mismo cocotero, en el cual se obtuvieron patrones ISTR idénticos. El hecho de que los cebadores ISTR marcados con DIG puedan sustituir al marcaje radioactivo, permite ampliar su uso con un mínimo de equipamiento técnico y de manipulación y sin restricción por la disponibilidad de la radioactividad o la presencia de laboratorios radioisótopos. Los esfuerzos actuales están dirigidos hacia el uso de cebadores ISTR marcados fluorescentemente para el establecimiento de análisis a gran escala. Las aplicaciones prácticas del ISTR están aparentemente centuplicadas y pueden recorrer (en el campo de las plantas) desde la determinación general de la biodiversidad, la caracterización de especies silvestres, manejo de banco de genes, estudio sobre la genética de las poblaciones, huellas de variedades para su identificación, siguiendo la introgresión de genes, estudios sistemáticos hasta una posible selección asistida por marcadores en el mejoramiento por la identificación de marcadores co-segregantes con caracteres deseables. Las posibles aplicaciones en el campo animal y humano deben ser determinadas todavía. Esta técnica puede ser útil para la identificación de genotipos, por ejemplo, en el aguacate. Ramirez y colaboradores (2001) evaluaron el polimorfismo de estas secuencias espaciadoras en un grupo de 18 variedades del germoplasma cubano de aguacate. El 100% de los genotipos fueron distinguidos usando una única combinación de cebadores, por lo que cada genotipo fue caracterizado por un patrón de bandas específico. Estos resultados refuerzan la potencialidad de esta técnica para este tipo de análisis. Otro de sus usos puede ser en el estudio de la biodiversidad genética. Dentro de esta línea está el trabajo de Sensi y colaboradores (1996) con accesiones italianas de uva. Los resultados obtenidos fueron casi idénticos a los mostrados por la técnica AFLP en esos mismos genotipos e incluso tuvieron un valor mayor ya que el ISTR detectó más diversidad genética entre las varias accesiones de uno de los cultivares de uva. Esta correspondencia de resultados también la comparte con los RAPDs, donde el análisis por ISTR del germoplasma del cocotero africano del este (EAT) procedente de Tanzania y Kenya, mostró resultados de biodiversidad comparables con la técnica RAPD. Una reevaluación de la técnica RAPD por ISTR confirmó los agrupamientos obtenidos por la primera en 10 ecotipos filipinos (Rohde y colaboradores, 1999). Entre sus aplicaciones está también la caracterización de patógenos. Tal es el caso de su utilización en 18 aislados de P.palmivora , uno de los patógenos más importantes del coco, detectándose un total de 30 fragmentos de ADN polimórficos, los cuales fueron utilizados en un análisis de agrupamiento (Rohde y colaboradores, 1999). El agrupamiento de los aislados fue idéntico (con solo 2 excepciones) al obtenido por un análisis RAPD (M.Coffey, comunicaciones personales). El ISTR puede tener un valor potencial para identificar cruces ilegítimos, ya que permite seguir la introgresión de loci genéticos en un material híbrido. Esto lo demuestra el estudio que se realizó a 28 genotipos que representan el material de Africa y sudeste de Asia de Elaeis guineensis (palma aceitera), tanto como 2 palmas E.oleifera y 2 F1 del cruce entre E.guineensis y E.oleifera. Algunos de los marcadores polimórficos específicos para E.guineensis y E.oleifera están representados claramente en las 2 palmas híbridas (Rohde y colaboradores, 1999). • Marcadores basados en la PCR y la hibridación tipo Southern. Ø Amplificación aleatoria del polimorfismo de microsatélites (RAHM; RAMPO). La técnica de RAHM (Random Amplified Hybridization Microsatellite Polymorphisms), permite optimizar la información obtenida con cualquiera de las técnicas de la PCR, por ejemplo, las huellas de RAPDs, MP-PCR ó AMP-PCR. Las huellas de ADN detectadas con estas técnicas se refieren como marcadores de primera generación. La optimización consiste en la detección, mediante hibridación con sondas de huellas de microsatélites presentes en los amplicones sintetizados durante la PCR.

Los patrones de bandeado RAMPO obtenidos con MP -PCR y AMP-PCR han mostrado una mayor complejidad respecto a los detectados por RAPDs , sin embargo, son altamente reproducibles; además de que todas las diferentes secuencias principales de microsatélites pueden utilizarse como sondas. La mayoría de las posibilidades de combinaciones de iniciadores de RAPD y sondas de microsatélites, no son limitantes para hacer de la técnica RAMPO una fuente rica de marcadores moleculares. Esta técnica extiende la información contenida en geles de RAPDs ó MP-PCR al menos de 5-8 veces y las bandas obtenidas pueden ser clonadas y usadas para sondas de RFLPs o como puntos de inicio para el aislamiento de marcadores de microsatélite de locus específico (Valadez y Kahl, 2000). Bibliografía. (1) Adato y colaboradores (1995). Application of DNA fingerprints for identification and genetic

analysis of mango (Mangifera indica) genotypes. Journal of the American Society for Horticultural Science 120(2):259-264.

(2) Aggawal y colaboradores (1999). Phylogenetic relationships among Oryza species revealed by AFLP markers. Theoretical and Applied Genetics 98:1320-1328.

(3) Angiolitto y colaboradores (1999). Olive genetic diversity assessed using amplified fragmnet polymorphism. Theoretical and Applied Genetics 98:411-421.

(4) Barcelos y colaboradores (1998). Moleculars markers applied to the analysis of genetic diversity and to the biogeographic of Elaeis. In: Proceedings of the seminar on evolution, variation and classification of palms:191-201.

(5) Barker y colaboradores (19999. Characterization of genetic diversity in potential biomass willows (Salix spp.) by RAPD y AFLP analyses. Genome 42:173-183.

(6) Beismann y colaboradores (1997). AFLP analysis sheds light on distribution of two Salix species and their hybrid along a natural gradient. Molecular Ecology 6:989-993.

(7) Blanquer-Maumont y Crouau-Roy (1995). Polymorphism, monomorphism and sequences in conserved microsatellites in primate species. Journal of Molecular Evolution 41:492-497.

(8) Bruford y Wayne (1993). Microsatellites and their application to population genetic studies. Current Opinion In Genetics and Development 3:939-943.

(9) Butcher y colaboradores (1992). Patterns of genetic diversity and nature of breeding system in Melaleuca alternifolia (Myrtaceae). Australian Journal of Botany 40:365-375.

(10) Buteler y colaboradores (1999). Sequence characterization of microsatellites in diploid and polyploid Ipomoea. Theoretical and Applied Genetics 99:123-132.

(11) Callen y colaboradores (1993). Incidence and origin of Null alleles in the (AC)n microsatellite markers. American Journal of human Genetics 99:425-431.

(12) Castiglioni y colaboradores (19999. AFLP markers in a molecular linkage map of mize: co-dominant scoring and linkage group distribution. Theoretical and Applied Genetics 99:425-431.

(13) Chase y colaboradores (1996). Distant gene flow in tropical trees. Nature 383:398-3999. (14) Cioffi y colaboradores (1998). Genotyping with microsatellites markers. Molecular tools for

screening Biodiversity:195-201.

(15) Clegg y colaboradores (1999). The use of molecular markers in the management and improvement of avocado (Persea amaricaca Mill.). Chapingo , Seri horticultura 5, No. Especial:227-231.

(16) Crouch y colaboradores (1998). Perspectives on the application of biotechnology tp assist the genetic enhacement of plantain and banana (musa spp.). Electronic Journal of Biotechnology, vol 1, No 1, april. Review article.

(17) Deqiu y colaboradores (1997). Firngerprinting trifoliate orange germplasm accesions with isozymes, RFLPs and inter-simple sequence repeat markers. Theoretical and Applied Genetics, Abstract vol 95, No ½:211-219.

(18) Deqiu y colaboradores (1998). Phylogenetic relationships among selected Citrus germplasm accesions revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. J.Amer.Soc.Hort.Sci 123(4):612-617.

(19) Dettori y Palombi (2000). Identification of Feijoa sellowiana Berg accesions by RAPD markers. Scientia Horticulturae 86:279-290.

(20) Dowling y colaboradores 81997). Nucleic Acids III: Analys is of fragments and restriction sites. Molecular systematics, 2nd edition:249-320.

(21) Dror y colaboradores (1992). Application of DNA fingerprints for identification and genetic analysis of Carica papaya and other Carica species. Euphytica 62:119-126.

(22) Duval y colaboradores (2001). Molecular diversity in pineapple assessed by RFLP markers. Theoretical and Applied Genetics, Abstract vol 12, No 1:83-90.

(23) Eiadthong y colaboradores (1999). Analysis of phylogenetic relationships in Mangifera by restriction site analysis of an amplified region of cpDNA. Scientia Horticulturae 80:145-155.

(24) Escaravage y colaboradores (1998). Clonal diversity in a Rhododendron ferrugineum L. (Ericaceae) population inferred from AFLP markers. Molecular Ecology 7:975-982.

(25) Grimaldi y Crouau-Roy (1997). Microsatellite allelic homoplasy due to variable flanquing sequences. Journal of Molecular Evolution 44:336-340.

(26) Harris (1999). Molecular approaches to assessing plnat diversity. Plant Conservation Biotechnology:11-24.

(27) Hartl y Lindhout (1998). Diversity of selected hop cultivars detected by flourescent AFLPs. Theoretical and Applied Genetics 96:112-116.

(28) Hokanson y colaboradores (1998). Microsatellite (SSR) markers reveal genetic identities, genetic diversity and relationships in a Malusx domestica Borkh. core subset collection. Theoretical and Applied Genetics 97:671-683.

(29) Huang y sun (1999). A modified AFLP with flourescence-labelled primers and automated DNA sequencer detection for efficient fingerprinting analysis in plant. Biotechnology Techniques 13:277-278.

(30) Jarne y Lagoda (1996). Microsatellites, from molecules to populations and back. Trends in ecology and Evolution 11:424-429.

(31) Kardolus y colaboradores (1998). The potential of AFLPs in biosystematics: a firts application in Solanum taxonomy (Solanaceae). Plant systematics and Evolution 210:87-103.

(32) Karp y colaboradores (1996). Molecular techniques in the assessment of Botanical Diversity. Annals of botany 678:143-149.

(33) Karp y colaboradores (1997). Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. International plant Genetic Resources Institute. Technical Bulletin No.2.

(34) Krauss y Peakall (1998). An evaluation of the AFLP fingerprinting technique for the analysis of paternity in natural populations of Persoonia mollis (Proteaceae).Australian Journal of botany 46:533-546.

(35) Lamboy (1994). Computing genetic distance similarity coefficients from RAPD data: the effects of PCR artifacts. PCR methods and Applications 4:31-37.

(36) Lavi y colaboradores. Methodology of generation and characteristics of simple sequence repeat DNA markers in avocado (Persea americana Mill.). Euphytica 80:171-177.

(37) Lercetau y Sznidt (1999). Properties of AFLP markers in inheritance and genetic diversity studies of Pinus sylvestris L. Heredity 82: 252-260.

(38) Lin y Kuo (1995). AFLP, a novel PCR-based assay for plant and bacterial DNA fingerprinting. Focus 17:66-70.

(39) López-Valenzuela y colaboradores (1997). Geographic differentiation and embryo type identification in Mangifera indica L. cultivars using RAPDs markers. Hort.Science 32(6):1105-1108.

(40) Lynch y Milligan (1994). Analysis of population genetic structure with RAPD markers. Molecular Ecology 3:91-99.

(41) Magdalita y colaboradores (1997). Morphological, molecular and cytological analyses of Carica papaya x C.cauliflora interespecific hybrids. Theoretical and Applied Genetics, Abstract vol 95, No 1/2:224-229.

(42) Matthes y colaboradores (1998). Amplified fragment lenght polymorphism (AFLP). Molecular tools for escreening biodiversity:183-190.

(43) Maughan y colaboradores (1996). Amplified fragment length polymorphism (AFLP) in soybean: species diversity, inheritance and near-isogenic line analysis. Theoretical and Applied Genetics 93:392-401.

(44) McCouch y colaboradores (1997). Microsatellite marker development, mapping and application in rice genetics and breeding. Plant molecular Biology 35:89-99.

(45) Mhameed y colaboradores (1997). Genetic relationships within avocado (Persea americana Mill.) cultivars and between Persea species. Theoretical and Applied Genetics 94:279-286.

(46) Moretzohn y colaboradores (2000). RAPD linkage mapping of the shell thickness locus in oil palm (Elaeis gineensis).Theoretical and Applied Genetics 100:63-70.

(47) Moretzsohn y colaboradores (2000). RAPD linkage mapping of the shell thickness locus in oil palm (Elaeis guineensis Jack.). Theor.Appl.Genet 100:63-70.

(48) Morganre y Olivieri (1993). PCR-amplified microsatellites as markers in plants. Plant J. 3:175-182.

(49) Morgante y colaboradores (1998). Isolation of mocrosatellite markers in plants. Molecular tools for screening Biodiversity:288-296.

(50) Moxon y Wills (1999). DNA microsatellites: agents of evolution? Scientific American, january:72-77.

(51) Nakajima y colaboradores (1998). Characterization of genetic diversity of nuclear and mitochondrial genomes in Daucus varie ties by RAPD and AFLP. Plant Cell Reports 17:848-853.

(52) Page y Holmes (1998). Molecular evolution: A phylogenetic approach. Oxford. (53) Perera y colaboradores (1998). Evaluating genetic relationships between indigenous

coconut (Coco nucifera) accesions from Sri Lanka by means of AFLP profiling. Theoretical and Applied Genetics 96:545-550.

(54) Perera y colaboradores (1999). Identification and characterization of microsatellite loci in coconut (Cocos nucifera L.) and the analysis of coconut populations in sri Lanka. Molecular Ecology 8:335-346.

(55) Powell y colaboradores (1996). Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in plant science:reviews, july, vol 1, No 7:215-222.

(56) Qi y Lindhout (1997). Development of AFLP markers in barley. Molecular and General Genetics 254:330-336.

(57) Rafalsky y colaboradores (1996). Generating and using DNA markers in plants. Non-Mammalian Genomic Analysis: Apractical Guide:75-134.

(58) Ramirez y colaboradores (2001). Inverse sequence-tagged repeat (ISTR) polymorphism in avocado (Persea americana Mill.). In press.

(59) Ravishankar y colaboradores (2000). Assessment of genetic relatedness among mango cultivars of India using RAPD markers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology 75(2):198-201.

(60) Regner y colaboradores 82000). Molecular markers for genotyping gravepine and for identifying clones of traditional varieties. Acta horticulturae 546: International Symposium on molecular Markers for charcterizyng and Identifying Cultivars in Horticulture.

(61) Ridout y donini (1999). Use of AFLP in cereal research. Trends in Plant science 4:76-79. (62) Rieseberg (1996). Homology among RAPD fragments in interespecific comparisons.

Molecular Ecology 5:99-103. (63) Rivera y colaboradores (1999). Isolation y characterization of polymorphic microsatellites

in Coco nucifera. Genome 42:668-675. (64) Rohde (1996). Inverse sequence-tagged repeat (ISTR) analysis, a novel and universal PCR-

based technique for genome analysis in the plant and animal kingdom. J.Genet and Breed. 50:249-261.

(65) Rohde y colaboradores (19999. Analysis of coconut germplasm biodiversity by DNA markers technologies and construction of a genetic linkage map. Current Advances in Coconut Biotechnology:99-120.

(66) Rossetto y colaboradores (1999). Microsatellite variation and assessmnet of genetic structure in teatree (Melaleuca alternifolia -Myrtaceace). Molecular ecology 8:633-643.

(67) Schlöttere y pembertom (1994). The use of microsatellites for genetic analysis of natural populations. Molecular Ecology and Evolution: Approaches and Applications:203-214.

(68) Schnell y colaboradores (1995). Identification of cultivars and validation of genetic relationships in Mangifera indica L. using RAPD markers. Theor.Appl.Genet 90:269-274.

(69) Schnell y colaboradores (2001). Use of RAPD markers to determine parentage in Mangifera indica L. Donnerstay 10.

(70) Sensi y colaboradores (1996). Characterization of genetic biodiversity with Vitis vinifera L. Sangiovese and Colorino genotypes by AFLP and ISTR DNA marker tecnology. Vitis 35.183-188.

(71) Somsri (1999). Improvement of papaya (Carica papaya L.) for South-east Queensland. Investigation of sex-type and friut quality. Summary of PhD Thesis.

(72) Sondur y colaboradores (1995). Agenetic linkage map of papaya based in randomly amplified polymorphic DNA markers. Submitted to theor.Appl.Genet.

(73) Strand y colaboradores (1993). Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismacht repair. Nature 365:274-276.

(74) Streiff y colaboradores (1999). Pollen dispersal inferred from paternity analysis in a mixed oak stand of Quercus robur L. and Quercus petraea (Matt) Liebl. Molecular Ecology 8:831-841.

(75) Swofford y colaboradores (1997). Phylogenetic inference. Molecular Systematics, 2nd edition:407-514.

(76) Swofford y Olsen (1990). Phylogeny Reconstruction. Molecular Systematics:407-514. (77) Travis y colaboradores (1996). An anlysis of genetic variation in Astragalu cremnophylax

var.cremnophylax, a critically endangered plant, using AFLP markers. Molecular ecology 5: 735-745.

(78) Ujino y colaboradores (1998). Develpoment and polymorphism of simple sequence repeat DNA markers for Shorea curtisii and other Dipterocarpaceae species. Heredity 81: 422-428.

(79) Ulanowsky y colaboradores (2000). Characterization of gravepine accesions at germplasm banks with RAPD and microsatellite markers. Acta horticulturae 546: International Symposium on molecular Markers for charcterizyng and Identifying Cultivars in Horticulture.

(80) Vladez y Kahl (2000). Huellas de ADN en genomas de plantas. Mundi-Prensa México. (81) Vos y colaboradores 81995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic

Acids Research, vol 23, No. 21:4407-4414.

(82) Waugh y Powell (1992). Using RAPD markers for crop improvement. Tibtech, jun, vol 10:186-191.

(83) Weber y may (1989). Abundant vlass of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction. Am.J.Genet 44:388-396.

(84) White y Powell (1997a). Cross-species amplification of SSR loci in Meliaceae family. Molecular ecology 6:1195-1197.

(85) White y Powell (1997b). Isolation and characterization of microsatellite loci in Swietenia humulis (Meliaceae):an endangered tropical harwood species. Molecular Ecology 6:851-860.

(86) Winfield y colaboradores (1998). A study of genetic diversity in Populus nigra subsp.betulifolia in the Upper Seven are of the UK using AFLP markers. Molecular Ecology 7:3-10.

(87) Xu y colaboradores (1999). High-resolution mapping of loci conferring resistance to sugarcane mosaic virus in mize using RFLP, SSR and AFLP markers. Molecular and General Genetics 261:574-581.