pulso y caza con actina marcada 1’ 2’ 40’’ fascina drf vasp pfn cdc42, n-wasp, toca-1, el...
TRANSCRIPT
Revenu et al., Nature RMCB2004
Extensiones citoplasmáticas basadas en el citoesqueleto de actina
células epiteliales intestinales, riñón
células sensoriales del órgano de Corti
células mecano-sensoras (Drosophila)
fibroblastos, conos de crecimiento neuronales
fasciculación y entrecruzamiento
unión a membrana
SEM SEM SEM
TEM
platinum replica EM
Lamelas, pliegues y filopodios son extensiones citoplasmáticas dinámicas observables en células migratorias
Extensiones planas y delgadas adheridas al substrato se denominan lamelas; extensiones que no se adhieren y que se pliegan sobre la parte ¨superior¨ de la célula se denominan "ruffles". Proyecciones con forma de aguja adheridas al substrato se denominan filopodios.
ruffles
VIDEO 5
filopodios
lamela
fibroblasto lamelipodio
citoplasma en retracción
(cola)
citoesqueleto de actina (rojo) predominante en la lamela y filopodios. Los microtúbulos (verde) terminan en un dominio proximal.
Paglini et al JCB 1998
Suter & Forscher J. Neurobiol. 2000
lamela
filopodios
La marcación con falloidina fluorescente revela la abundancia de los filamentos de actina en filopodios, lamela y lamelipodio
axón
lamela de
avance
Se denomina lamelipodio a una franja rica en actina, de 2-4 μm de ancho, adyacente al margen de avance de la lamela.
Diferentes arreglos 3D: Fascículos y redes de microfilamentos
Los filamentos de actina adquieren diferentes arquitecturas que se asocian a las fuerzas de compresión (flechas rojas) y tensión (flechas verdes) que enfrentan. Los filamentos en lamelipodios y filopodios generan fuerzas protrusivas. Las redes corticales no alineadas por debajo de la membrana plasmática y los fascículos de filamentos en las fibras de estrés generan tensión. La decoración con el fragmento S1 de miosina revela la orientación de los filamentos.
fascina
compresión
tensión
Varias proteínas se unen a actina mediante dominios CH (Calponin-Homology, azul). Proteínas monoméricas con más de un dominio CH (ej. fimbrina), o diméricas, con un solo CH en cada monómero (espectrina), contribuyen a interconectar los filamentos de actina. El número y ubicación de los dominios CH en las proteínas que unen actina determinan el arreglo tridimensional que estabilizan. Alguna proteínas contienen sitios de unión a Ca2+ (violeta) que es capaz de inhibir su función a altas concentraciones. Distrofina conecta filamentos de actina a la membrana a través de la interacción con distroglicano.
Numerosas proteínas contribuyen a la organización tridimensional de los filamentos de actina
α-actinina
Fimbrina
Espectrina
Filamina
Distrofina
microvellosidades filopodios adhesiones focales
fibras de stress filopodios línea Z (músculo)
corteza celular
frente de avance fibras de stress
filopodios
enlace entre proteínas de membrana y actina cortical en músculo
membrana plasmática
Localización
Organización 3D de los microfilamentos. Microscopía electrónica
Fascículos de microfilamentos unidos por fimbrina
Redes de microfilamentos conectados por filamina tienen propiedades de geles laxos y viscosos
Lodish et al., MCB2004
El espaciamiento y capacidad contráctil de los filamentos de actina en los fascículos depende del tipo de proteínas accesorias
Alberts et al., MCB2002
Fascículo contráctil el mayor espaciamiento permite la unión de miosina II entre los filamentos. Ej. en fibras de estrés.
filamentos de actina y αα-actinin
F-actina vinculina
Fascículo no contráctil el empaquetamiento denso de microflamentos impide la asociación de miosina. Ej. en filopodios.
F-actina tubulina
filamentos de actina y fimbrina
Los filopodios son estructuras dinámicas
Muestreo del entorno a) migración celular
- receptores para moléculas de señalización y de la matriz extracelular - transducción de señales
b) fagocitosis Adhesión célular
- formación de uniones adherentes entre células epiteliales, cicatrización de heridas, cierre dorsal en embriones de D. melanogaster
- filopodios interdigitados que protruyen de células enfrentadas forman uniones adherentes maduras de manera dependiente de Ca2+
Guía de axones - los filopodios en los conos de crecimiento sensan los gradientes de señales del entorno que guían
las neuritas hacia un quimioatractante
Los conos de crecimiento neuronales son sitios de elongación de axones y dendritas
Dent & Gertler, Neuron, 2003
Los conos de crecimiento varían en morfología, extienden una lamela con numerosos filopodios. La estructura y dinámica de la región periférica de los conos de crecimiento (P) depende del citoesqueleto de actina (en rojo). Los microtúbulos abundan en la región central (C) del cono.
actina
tyr-MTs
ace-MTs
lamela de keratinocito
Lamelas y lamelipodios exhiben redes de filamentos de actina La parte distal de la lamela, denominada lamelipodio, exhibe una red dendrítica de filamentos de actina. En el frente de avance se observan los extremos de filamentos.
Svitkina et al, JCB 1997 VIDEO 6 y 7
frente de avance
zona de transición
Imágenes de microscopía electrónica de filamentos orientados perpendicularmente en el lamelipodio. La inmunotinción con oro coloidal revela la localización de filamina en los sotios de unión de filamentos
El complejo Arp2/3 y ADF/cofilina tienen actividades antagónicas en el lamelipodio de células migratorias
En el frente de avance del lamelipodio los filamentos de actina están organizados en rededes ramificadas. En las uniones en Y se localizan los extremos (-), donde la inmunotinción con partículas de oro coloidal revela la presencia del complejo Arp2/3. El factor de depolimerización de actina (ADF/cofilina) queda excluido del frente de avance.
Arp2/3
actina
ADF actina
ADF
Arp2/3
En el lamelipodio los complejos Arp2/3 se asocian a filamentos preexistentes y nuclean la polimerización de actina
EL modelo de nucleación dendrítica para la protrusión de lamelipodios implica el treadmilling de un arreglo ramificado de filamentos de actina. El complejo Arp2/3 nuclea nuevos filamentos que se integran a la red de actina en el frente de avance. Las proteínas de capping terminan la elongación. ADF/cofilina promueve el desensamblado de filementos en la zona posterior de la red.
Alberts et al., MCB2002
La fasciculación y elongación de filamentos de actina en la región distal de la lamela puede generar filopodios
Svitkina et al JCB 2003
los círculos señalan ramas a partir de las cuales se originan filamentos de actina que se empaquetan y forman el esqueleto del filopodio.
filopodio
red dendrítica de actina
La flecha indica la elongación de un filopodio. La línea de puntos marca el borde de la célula.
Svitkina et al JCB 2003
La fasciculación de los filamentos de actina en los precursores de los filopodios depende de la proteína fascina
La clave para la iniciación de un filopodio es la fasciculación (mediada por fascina) de los filamentos de actina y la inhibición de los mecanismos que bloquean la elongación, por ejemplo, por asociación de proteínas ENA/VASP que antagonizan la función de las proteínas de capping .
filop
odia
pre
curs
ors
lam
ellip
odiu
m
Yang et al Plos Biol 2007
Una formina elonga los filamentos de actina en la región distal de la lamela durante la formación de filopodios
0:00 0:50 1:30
GFPΔGBD-mDia2
(1) La nucleación dependiente de Arp2/3 forma la red de actina de lamelipodios. (2) Los extremos más de algunos filamentos de actina se asocian con forminas o VASP. (3) La interacción entre los extremos de filamentos asociados con forminas o VASP converge en la elongación de filamentos paralelos. (4) Entecruzamiento mediado por fascina. (5) Disociación de Arp2/3 del extrremo menos.
Yang & Svitkina. Cell Adh Migr 2011
VIDEOS 8 y 9
Lee. Science 2010
El ensamblado de los filopodios puede reconstituirse in vitro
Pulso y caza con actina marcada
1’
2’ 40’’
fascina Drf VASP Pfn
Cdc42, N-WASP, toca-1, el complejo Arp2/3 y actina son los componentes mínimos para estimular la nucleación de actina sobre una bicapa lipídica que contiene PIP2. El agregado de extractos de ovocitos de Xenopus promueve el crecimiento de estructuras tipo filopodio.
Microscopía TIRF
actin
a
Cinética del recllutamiento de proteínas de señalización a FLSs
En células epiteliales, el anclaje del citoesqueleto cortical de actina a la membrana plasmática es mediado por la familia de proteínas ERM Ezrina, Radixina y Moesina son miembros de la familia de proteínas ERM. ERMs son necesarias para el mantenimiento de la polaridad celular y están involucradas en exocitosis y endocitosis.
La conformación activa de las proteínas ERM, que permite la unión a la actina por el C-t y a proteínas de la membrana plasmática por el N-t es regulado por fosforilación y unión a fosfoinosítidos fosforilados (PIP2).
Las interacciones entre la membrana y el citoesqueleto subcortical de espectrina y actina es esencial para la función de los eritrocitos
s = spectrin
microscopía electrónica de la red cortical de espectrina
Espectrina es un heterodímero que se asocia cabeza con cabeza formando tetrámeros de unos 200 nm de longitud. Los tetrámeros se unen a filamentos de actina en sitios denominados "nodos” o complejos de anclaje formando una malla bidimensional. Espectrina se ancla a la membrana plasmática a través de su unión a las proteínas periféricas ankirina y banda 4.1.
complejos de anclaje a actina o nodos
Complejo de anclaje: Tropomiosina: unión a 6-7 subunidades de actina en el surco de un filamento
Tropomodulina: cap del extremo (-)
Gelsolina y severina inducen la fragmentación de los microfilamentos y el “capping” de los extremos (+). La actividad de gelsolina es regulada positivamente por calcio. Gelsolina es removida del extremo (+) por el aumento en PIP2.
Los arreglos tridimensionales de actina son dinámicos y dependen de la actividad de numerosas proteínas reguladoras
trombina receptor acoplado PLC ↑DAG/IP3 Ca++ ↑gelsolina a proteína G
capping del extremo (+) impide el crecimiento
(-)
(+)
el fragmento formado se depolimeriza por el extremo (-)
Ca++
Vía de señalización que activa a gelsolina
Dos subdominios de gelsolina se unen a sitios diferentes en la subunidad de actina
↑ PIP2
La remodelación del citoesqueleto de actina en plaquetas es esencial para su función
plaqueta inactiva activa
La activación de plaquetas por trombina involucra cambios morfológicos rápidos que son promovidos por la reorganización del citoesqueleto de actina. Este proceso depende de proteínas como gelsolina y profilina cuya actividad es coordinada por señales citosólicas como el Ca2+ y el PIP2.
lamela contracción mediada por miosina II
INACTIVATES
Cambios de forma y plasticidad del citoesqueleto de actina en células epiteliales
(a) En una célula epitelial en reposo la proteína villina se localiza en los ramilletes de microfilamentos en las microvellosidades y también asociada a PIP2 en membranas. (b) En respuesta a la estimulación de ciertos receptores (ej. EGFR) y activación de PLC, se hidroliza el PIP2 y aumenta el calcio citosólico. La liberación de villina de la membrana y su unión a Ca++ activa su función de fragmentar filamentos de actina, promoviendo la remodelación del arreglo tridimensional de la actina.
Revenu et al, Nature RMCB 2004
polarización
motilidad
Cambios en las concentraciones de calcio citosólico afectan la reorganización de la actina
La fluorescencia del compuesto Fura 2 incrementa proporcionalmente a su unión a Ca++. Esta fluorescencia puede ser visualizada en un microscopio. Debajo se visualiza en pseudocolor los niveles de fluorescencia (azul = min rojo = max) en un leucocito. La existencia de un gradiente revela picos de niveles de calcio en la región de la célula opuesta al margen de avance.
En el frente de avance de la célula, las bajas concentraciones de Ca2+ favorecen la formación de redes de actina activando miosina I, inactivando proteínas que fragmentan filamentos de actina y revirtiendo la inhibición de proteínas de cross-linking reguladas por Ca2+. El aumento de las concentraciones de Ca2+ en la región opuesta al margen de avance favorece el desensamblado de redes de actina estimulando la actividad de gelsolina y la contracción mediante la activación de miosina II.
margen de avance
↑ Ca++
Las proteínas motoras convierten energía química en trabajo mecánico
Los motores moleculares se mueven sobre
filamentos de actina (miosinas) y microtúbulos
(kinesinas y dineínas)
Las proteínas motoras son enzimas que hidrolizan
ATP para generar trabajo mecánico
El acoplamiento de los ciclos mecánico y químico
produce un ciclo que genera “fuerza”
Cada ciclo de hidrólisis de ATP está asociado a un cambio conformacional
que resulta en el movimiento de un “paso”
sobre el filamento
Kull & Endow (2013) JCS
kinesina miosina
Kinesina y miosina comparten elementos estrucutrales
Miosina V es uno de los 20 tipos de miosinas y kinesina 1 pertenece a una familia de proteínas motoras. Los dominios motores (azul) de kinesina y miosina tienen un core catalítico común. Una hélice (verde) comunica el sitio catalítico con el sitio de unión al polímero y el elemento mecánico (amarillo) que son distintos para kinesina y dineína. Las dineínas pertenecen a otra clase de motores moleculares
Cabeza (dominio motor): - hidrólisis de ATP - unión a microfilamentos (miosina) y microtúbulos (kinesina y dineína)
Cola: - unión al cargo - regulación
miosina V
kinesina-1
dineina
Carter (2013) JCS
Vale (2000) Science
Las miosinas constituyen una gran superfamilia de proteínas motoras asociadas a filamentos de actina
Todas las miosinas consisten de una o dos cadenas pesadas y una o var ias cadenas l iv ianas. Las cadenas pesadas exhiben tres dominios, cabeza, cuello y cola. Las cabezas tienen actividad ATPasa y junto con el cuello acoplan la hidrólisis de ATP al movimiento a lo largo de un filamento de actina. La función de las miosinas in vivo está determinada por la cola. Las colas de las miosinas I y V interaccionan con membranas. Las colas de las miosinas II interaccionan entre si formando f i lamentos gruesos bipolares de cuyos extremos proyectan las cabezas.
Microscopía electrónica freeze etch
Ensayos in vitro revelan el desplazamiento de filamentos de actina sobre moléculas de miosina en una manera dependiente de la hidrólisis de ATP
Filamentos de actina (1-3 en b) se desplazan sobre moléculas de miosina adsorbidas a un vidrio. Las cabezas se desplazan hacia el extremo (+) de los filamentos de actina en un proceso dependiente de ATP.
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
La fuerza de torque generada por la hidrólisis del ATP puede medirse empleando trampas láser
Empleando trampas ópticas láser se determinó que la miosina II se mueve en pasos discretos de ~10 nm de largo y genera 3-5 picoNewton (pN) de fuerza. Los pasos discretos indican que durante su movimiento la miosina II se une a monómeros sucesivos en los protofilamentos. Las fuerzas determinadas son suficientes para mover cargos (ej. vesículas) en el citoplasma.
La luz de un láser infrarojo se enfoca, a través del microscopio, sobre una partícula de látex, reteniéndola en el centro del haz de luz. La fuerza ejercida por la molécula motora provoca un desplazamiento de la partícula respecto del centro de la trampa que puede ser medido y relacionado con la fuerza ejercida.
haz de láser esfera en el centro de la trampa
(2) En el estado unido a ADP-Pi la cabeza se une débilmente a la actina
(3) La liberación del Pi de la cabeza motora incrementa la afinidad por la actina e induce un cambio conformacional del brazo móvil y una fuerza de torque que mueve al resto de la molécula de miosina sobre el filamento de actina ~10 nm
(4) El reemplazo del ADP por ATP induce la disociación de la miosina del microfilamento.
(1) Las cabezas motoras se conectan mediante un brazo móvil a la región rígida coiled coil de las colas. La hidrólisis del ATP extiende el brazo móvil ~ 10 nm hacia el extremo (+).
Vale & Milligan, Science 2000
Modelo del movimiento de la miosina II sobre el filamento de actina
(+) (-)
filamento de actina
Vale (2000) Science
Miosina II es requerida en diversos eventos celulares
estructuras contráctiles formadas por actina y miosina II
miosina II
surco de segmentación miosina I
polo Microscopía de fluorescencia de una a m e b a D i c t y o s t e l i u m d u r a n t e citoquinesis. La localización de miosina II en el surco de segmentación revela su rol durante la citoquinesis
El sarcómero es la unidad estructural y funcional del músculo esquelético Cada sarcómero contiene: filamentos gruesos de miosina II y filamentos finos de actina. Las moléculas de titina están asociadas a un extremo con los filamentos gruesos de miosina y funcionan como un resorte. El disco Z (CapZ y α-actinina) funciona como cap de los extremos más de los filamentos de actina. Nebulina funciona como un molde que determina la longitud de los filamentos. Tropomodulina es el cap en el extremo menos de los filamentos finos.
+ATP, Ca2+
La contracción del músculo esquelético está regulada por Ca2+ y proteínas de unión a actina
En un ciclo de contracción la hidrólisis de ATP se acopla al movimiento de una cabeza de miosina hacia el dico Z (VIDEO). La acción de las cabezas de miosina en los extremos opuestos del filamento grueso atrae a los filamentos finos hacia el centro del sarcómero
La concentrac ión de Ca2+ citosólico modula la interacción de tropomiosina (TM) y troponina (TN) con los filamentos de actina. En ausencia de Ca2+ el complejo TM-TN impide que la miosina se deslice a lo largo del filamento fino. La unión de Ca2+ a la subunidad C de TN (TN-C) gatilla un movimiento de TM que expone los sitios de unión a miosina en la actina.
En las células del músculo e s q u e l é t i c o , e l r e t í c u l o sarcoplásmico es rico en Ca2+ y b o m b a s d e C a 2 + . L a señalización a través de una célula nerviosa provoca la d e p o l i m e r i z a c i ó n d e l a m e m b r a n a d e l a c é l u l a m u s c u l a r q u e a s u v e z depolariza los túbulos T. Los túbulos T están asociados al retículo sarcoplásmico. La depolarización de los túbulos T permite la apertura de los canales de Ca2+ del retículo sarcoplásmico provocando un aumento del Ca2+ citosólico.
El sarcómero es la unidad contractil en el contexto de las miofibrillas