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DAMAS BUENROSTRO, LUIS C.; PEREYRA ALFÉREZ, BENITO

Control genético de la floculación de Saccharomyces cerevisiae en proceso de

fermentación industrial

Ciencia UANL, Vol. XII, Núm. 4, octubre-diciembre, 2009, pp. 417-429

Universidad Autónoma de Nuevo León

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CIENCIA UANL / VOL. XII, No. 4, OCTUBRE - DICIEMBRE 2009 417

LUIS C. DAMAS BUENROSTRO*, BENITO PEREYRA ALFÉREZ*

En la industria de fermentaciónalcohólica, la separación de lascélulas de levadura del productodepende en gran medida de la ca-pacidad de éstas para agregarse encúmulos y sedimentar. Este fenó-meno, llamado floculación, es

espontáneo y simplifica las operaciones para clari-ficación del producto y recuperación de la levadu-ra para reuso.1,2 Sin embargo, existen diversas con-diciones de proceso que afectan la calidad fisioló-gica de la levadura y que eventualmente se hanasociado con fallas en el mecanismo de floculación.Entre éstas se encuentran algunas que actualmen-te son muy comunes en los procesos de produc-ción: a) alta relación altura:diámetro del fermen-tador (que provoca mayor presión hidrostática);b) mayor concentración total de azúcares (que de-termina una mayor presión osmótica en el me-dio); c) el perfil de carbohidratos del medio (ma-yor relación glucosa:maltosa, que puede causarrepresión catabólica); d) almacenaje prolongado dela levadura (que expone a las células a un agota-

miento de nutrientes) y e) reuso seriado en fer-mentaciones subsecuentes.3 Al no poder separarcon facilidad las células, la industria tiene que re-currir al empleo de agentes floculantes (políme-ros catiónicos, colágeno, etc.), centrifugas o filtros,lo cual incrementa los costos de producción. A-demás, la presencia de levadura en el medio pro-voca autólisis de la misma, por la exposición pro-longada al etanol, y esto a su vez, lleva a la genera-ción de aromas y sabores desagradables (diacetilo,compuestos de azufre, ácidos grasos, etc.).1

A nivel celular, la floculación consiste en la agre-gación asexual de las levaduras por un mecanismode adhesión mediado por proteínas localizadas enla pared celular tipo lectinas (más propiamentellamadas zimolectinas).4,5 Este proceso tambiénpuede involucrar la formación de interaccioneshidrofóbicas y uniones inespecíficas débiles. Laszimolectinas reconocen residuos de manosa loca-lizados en la pared de células adyacentes, generan-do uniones especificas mediante puentes de hidró-geno entre los aminoácidos y los residuos demanosa.2, 6

Los genes que codifican para las zimolectinasson llamados FLO. Éstos incluyen genes dominan-

CCCCCononononontrtrtrtrtrol genéticol genéticol genéticol genéticol genético de la floo de la floo de la floo de la floo de la floculación deculación deculación deculación deculación deSSSSSaccharaccharaccharaccharaccharomomomomomyyyyyccccces ces ces ces ces cererererereeeeevisiaevisiaevisiaevisiaevisiae en pr en pr en pr en pr en proooooccccceso deeso deeso deeso deeso de

fermentación industrialfermentación industrialfermentación industrialfermentación industrialfermentación industrial

El presente artículo está basado en la investigación ″Controlgenético de la floculación de Saccharomyces cerevisiae enproceso de fermentación industrial″, galardonada con elPremio de Investigación UANL 2009 en la categoría de Cien-cias Biológicas, otorgado en sesión solemne del ConsejoUniversitario, en septiembre de 2009.

* Instituto de Biotecnología. Facultad de Ciencias Biológicas,

UANL.

CIENCIA UANL / VOL. XII, No. 4, OCTUBRE - DICIEMBRE 2009418

CONTROL GENÉTICO DE LA FLOCULACIÓN DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE EN PROCESO DE FERMENTACIÓN INDUSTRIAL

tes como FLO1 (FLO4), FLO2, FLO5, FLO8,

FLO9, FLO10, FLO11 y Lg-FLO1; y recesivos osemidominantes como flo3, flo6, flo7, fsu1, fsu2 yfsu3.7 FLO11 es el miembro más divergente de lafamilia (similitud 37% identidad 26%) y a dife-rencia de las demás floculinas (excepto FLO8), noestá localizado cerca del telómero, sino cerca delcentrómero en el brazo derecho del cromosomaIX.8 Se ha observado que la expresión del genFLO11 se incrementa más de diez veces hacia elfinal de la fermentación.9 Sin embargo, poco sesabe de los elementos regulatorios de esta expre-sión en fermentaciones industriales, ya que lamayoría de los estudios provienen de cepas Sac-

charomyces cerevisiae a nivel laboratorio enfocadosen FLO1.10,11 En general, se sabe que los genes conactividad represora sobre FLO11 son NRG1,NRG2, SOK2, SFL1, VHS3 y TUP1-SSN6, mien-tras que activadores son TEC1, FLO8, SWI-SNF,

PHD1, MSN1 y RME1.12-18

Se han realizado análisis de microarreglos deADN en S. cerevisiae, para conocer la expresiónglobal durante la fermentación y su relación conla producción de compuestos volátiles (responsa-bles del sabor y el aroma) y compuestos azufradosen mostos con bajo contenido nutricional o rela-ción malta:adjuntos menor.9,19 Otros se han enfo-cado a revelar los patrones de expresión globalesen fermentaciones industriales, comparándoloscon los primeros ensayos realizados en condicio-nes y con cepas de laboratorio.20-22 A la fecha nose han reportado estudios que permitan dilucidarlos mecanismos de expresión de la floculación,bajo condiciones de estrés como la presencia deglucosa, alta presión osmótica e hidrostática,senescencia o agotamiento de nutrientes en cepasde levaduras industriales.

En el presente trabajo reportamos el análisisde la expresión de los genes implicados en lafloculación (estructurales o regulatorios) bajo es-tas condiciones de fermentación, mediantemicroarreglos de ADN y PCR cuantitativa paraentender la manera del cómo estos factores deproceso industrial modulan la expresión de dichos

genes, lo que permitirá un manejo más racionalde los procesos de fermentación.

Materiales y métodos

Cepas de levadura: las cepas fueron proporcionadaspor la Cervecería Cuauhtémoc Moctezuma(CCM). Éstas fueron las cepas lager C820, C790,LAW, KJ8, BRY y J-2036; la cepa de panaderíaC7754. S. diastaticus, S. willianus y S. pastorianus

fueron obtenidas de American Type CultureCollection (ATCC, Rockville MD, USA).

Fermentaciones: las fermentaciones fueron reali-zadas por duplicado en probetas de 2 L usandomosto proporcionado por CCM. La densidad deextracto fue ajustada a 17 grados Plato (ºP), excep-to para los ensayos de estrés osmótico, donde a-demás se usaron fermentaciones a 12ºP, con unaconcentración inicial de oxígeno a 1 ppm / gradoPlato y el inóculo a 1.2 X106 cel/mL por gradoPlato. Las fermentaciones fueron incubadas sietedías a 16ºC. En los procesos se evaluaron las varia-bles siguientes: restricción calórica (levadura fres-ca-incubada 22 h en agua); represión catabólica(glucosa:maltosa 1:10; 10:6); presión osmótica(12°P-17°P); presión hidrostática (105 kPa-106 kPa);edad generacional (1a-10a generación). Los datosentre paréntesis indican la condición normal y lade estrés, respectivamente. El perfil de azúcares seajustó usando la enzima amiloglicosidasaAttenuzyme (Novozymes; Dittingen, Switzerland).De la levadura en suspensión al 3-5º día, se obtu-vieron 5 mL, los cuales fueron procesados paraextracción del ADN y ARN.

Aislamiento de ADN y ARN: las levaduras fue-ron lisadas a 65ºC por 10 min en presencia de10% SDS. El ADN genómico fue extraído confenol:cloroformo (24:1) y precipitado conisopropanol.23 El ADN fue resuspendido en bu-ffer TE y tratado con 5 U of RNase One (Promega,Madison WI, US) a 37°C por 30 min. El ADNfue cuantificado y almacenado a -20ºC hasta suuso. Para la extracción de ARN total, la concen-tración celular fue ajustada a 90 x 106 y se forma-


ron esferoplastos con 125 unidades de liticasa y elARN fue obtenido con estuche High Pure deRoche (Indianápolis, USA) y guardado a -80°C.

Evaluación de floculación: la medición de lafloculación se realizó esencialmente como se hareportado anteriormente,24 o como se indica enel Manual de Métodos de la American Society ofBrewing Chemists Yeast-11A (1999).25

PCR punto final de genes FLO, ACT1 y ADH1:diseñamos iniciadores para los genes Lg-FLO1,

FLO1, FLO5, FLO8, FLO9, FLO10, FL011, ACT1

y ADH1 utilizando las secuencias reportadas en elNational Center for Biotechnology Information(NCBI, 2006) y el Saccharomyces Genome Database(SGD, 2006, http://www.yeastgenome.org). Parael diseño se utilizaron los programas Megalign yGene Quest (ambos de DNASTAR Inc, v 4.05).Los iniciadores fueron analizados mediante alinea-miento iniciador-iniciador y con la base de datosdel NCBI usando el programa Basic LocalAlignment Search Tool (BLAST),26 y simulaciónde PCR in silico con ayuda de los programas FastPCR 6.0 (Rusland Kalendar Univ. Helsinki, Fin-landia) y Ampify 3.1. (Engels, Univ. WisconsinUS). La amplificación genética fue realizada bajoel siguiente esquema: 200 mM dNTPs, 1 mM decada uno los iniciadores, 1X buffer verde, 10 ngde ADN blanco y 2.5 unidades de Taq ADN poli-merasa (Go Taq. Promega) en un volumen totalde reacción de 50 mL y colocados en untermociclador Gene Amp PCR system 2400(Perkin Elmer Cetus Emeryville CA, US). Losparámetros de la PCR fueron: 94ºC por 5 min, yluego 35 ciclos de 30 s a 94ºC, 1 min a 52ºC y 1min a 72ºC; seguido por un paso final de exten-sión de 4 min a 72ºC. Los productos de PCRfueron analizados por electroforesis en gel deagarosa a 1.5% en TBE (Standard Low-mr. BioRad, Hercules CA, US) y teñidos con 5 mg/mLde bromuro de etidio. Los amplicones del tama-ño esperado fueron separados por electroforesispreparativa y purificados usando el sistema WizardSV Gel y PCR Clean-Up de Promega. La secuen-cia nucleotídica de los fragmentos purificados fue

determinada en el Instituto de Biotecnología deUniversidad Nacional Autónoma de México, usan-do un secuenciador Perkin Elmer/AppliedBiosystems modelo 3730.

Análisis de expresión génica por PCR cuantitativa

(qPCR): del ARN aislado de las fermentaciones,se realizó la síntesis de ADNc a partir de lostranscritos de FLO8, FLO11, Lg-FLO1, ACT1 yADH1 mediante PCR reversa con el kit ReverseTranscription MMLV (Promega). Para la síntesisse empleó un termociclador Gene Amp PCRsystem 2400 (Perkin Elmer Cetus). El ADNc sin-tetizado se guardó a -20°C hasta su uso. La qPCRfue llevada a cabo en un LightCycler 2.0 (RocheDiagnostics), empleando el programa LC 4.0 paralos análisis y el kit LightCycler Fast Start DNAMaster SYBR Green I (Roche Applied Science).Con el Software LC 4.0 se determinaron los Cp(crossing points, número de ciclo en el cual la fluo-rescencia supera el umbral predeterminado) de losamplicones, el cual es inversamente proporcionala la concentración inicial del ADNc presente en lamuestra.

Análisis de expresión global mediante microarreglos:

la preparación del ADNc a partir de los transcritosde todo el genoma de la levadura y su marcaje conCy3 y Cy5 se hizo de acuerdo a las indicacionesdel fabricante (Kits Promega Z3604, 23613 yZ3613). Los microarreglos YOMGW_01 fueronproporcionados por el Dr. Jorge Ramírez, del Ins-tituto de Fisiología Celular de la UniversidadNacional Autónoma de México. Los microarreglosfueron leídos con un escáner ScanArray 4000(Packard Biochips, Billerica MA, USA) y las imá-genes analizadas usando el programa Spotfinder(http: //www.tm4.org/ spotfinder.html), transfor-mados en valores de intensidad relativa de fluo-rescencia, y guardados como archivos .txt. Losdatos fueron posteriormente analizados con el pro-grama genArise (http://www.ifc.unam.mx/genarise). Para esto se calculó la razón de expre-sión diferencial logarítmica y la intensidad globalde cada spot. La razón logarítmica fue representa-da por el valor R = log

2 (intensidad Cy5) – log

2

LUIS C. DAMAS BUENROSTRO, BENITO PEREYRA ALFÉREZ



(intensidad Cy3), y la intensidad global por el va-lor I = log

10 (intensidad Cy5) + log

10 (intensidad

Cy3) y determinado el «Z score», se tomaron comolímite valores > 2 desviaciones estándar que seconsideraron como genes significativamente expre-sados de forma diferencial.35 Los grupos de genesidentificados con cambio significativo de expre-sión fueron posteriormente analizados mediantelos programas FatiGO (http: //babelomics2.bioinfo.cipf.es) y KEGG2 (http: //www.genome.jp), a fin de identificar relacionesontológicas significativas que permitieran determi-nar los procesos biológicos donde dichos genestuvieran anotaciones registradas en las bases dedatos.

Resultados y discusión

Impacto de las variables de estrés fisiológico en la

floculación: el efecto de las distintas variables deestrés sobre la floculación mostró diferencias sig-nificativas entre los tratamientos. El perfil deglucosa:maltosa de 10:6, contra el típico de 1:10,provocó un decremento significativo en lafloculación de 29-42% para las cepas C790 yC820. Por otra parte, las levaduras de generacio-nes altas mostraron un incremento en la capaci-dad floculante de 23-100% respecto a la primerageneración. La variación de las otras condicionesde estrés no tuvo un efecto significativo, determi-nado mediante la prueba T de Student (p<0.05).

La cepa de panadería C7754 resultó ser nofloculante. Por otra parte, el grado real de fermen-tación se mantuvo arriba de 60%, lo cual indicóque los carbohidratos del mosto fueron fermenta-dos sin mayor problema.3 La cantidad de alcoholproducida fue 4-6%, de acuerdo a lo esperado;32

y el diacetilo permaneció en los niveles aceptadospara fermentaciones lager (datos no mostrados).

De esta forma, estos resultados sugirieron quela capacidad de floculación y la fermentación sonregulados por vías diferentes y por lo tanto ofre-cen una oportunidad para conocer los factoresespecíficamente relacionados con el control de lafloculación, particularmente en las condiciones deestrés por alto contenido de glucosa y edadgeneracional. Sin embargo, el análisis de la expre-sión a nivel transcripcional por qPCR de proteí-nas claves para la fisiología celular en fermenta-ción (b-actina y alcohol deshidrogenasa), demos-tró que aunque la condición de perfil de carbohi-dratos alto en glucosa no afectó la expresión géni-ca de estos marcadores, la edad generacional sí tuvoimpacto (dato no mostrado). Por esta razón, elmejor modelo de estudio de los factoresregulatorios de la floculación lo ofrece precisamen-te la condición de alto nivel de glucosa y los análi-sis de expresión global se encaminaron a este mo-delo.

Detección de genes FLO: amplificamosexitosamente secuencias específicas de los 7 genesFLO dominantes (figura 1). La identidad de los

Fig. 1. Productos de PCR de los genes FLO de las cepas de levadura. (A) BRY (lager), (B) cepa C7754 (panadería), y (C) S. diastaticus

(silvestre). Carriles: 1, marcador 100-1000 pb; 2, Lg-FLO (312 pb); 3, FLO5 (423 pb); 4, FLO9 (347 pb); 5, FLO8 (920 pb); 6,

FLO10 (270 pb); 7, FLO11 (749 pb); 8, FLO1 (596 pb).



fragmentos amplificados fue confirmada median-te secuenciación de ADN. La distribución de losgenes FLO, utilizando ADN genómico de levadu-ras lager, así como de cepas no cerveceras se mues-tra en la tabla I. Lg-FLO1, un gen relacionado alfenotipo NewFlo (sensible a glucosa y manosa)estuvo presente sólo en las levaduras lager. Por otraparte, todas las cepas lager probadas carecieron deFLO5. FLO8, un activador transcripcional deFLO1 y FLO11,8,29 estuvo presente en todas lascepas probadas, excepto en la levadura panadera.En relación a FLO9, los resultados concuerdancon aquéllos que han reportado la presencia deeste gen en algunas cepas, pero no en todas.2 Re-sultados similares fueron obtenidos con FLO1 yFLO10, cuya distribución no tuvo aparentemen-te relación el fenotipo de floculación.

Un caso muy interesante fue FLO11, que estu-vo presente en todas las cepas probadas, incluyen-do las levaduras silvestres. Esto concuerda con re-portes previos que señalan que FLO11 parece es-tar ampliamente distribuido.8 Los esfuerzos de lalevadura por retener este gen, evidenciado por laprevalencia en todas las cepas probadas hasta lafecha sugieren otras posibles funciones desconoci-das, lo que también se deduce del hecho de queFLO11 está sujeto a múltiples cascadas de regula-ción por cinasas como las vías cAMP/PKA yMAPK.29

Análisis de expresión de genes FLO: para determi-nar si los genes FLO detectados en las cepas lagereran expresados diferencialmente en presencia dealtos niveles de glucosa y edad generacional alta,se analizó la generación de transcritos de los genesFLO8, FLO11 y Lg-FLO1 por qPCR en las cepasC820 y C790, cultivadas en condiciones basalesy de estrés. El efecto fue más notorio para el genLg-FLO1, ya que aunque en la condición basal seobservaron niveles de expresión equivalentes en-tre las dos cepas, hubo un efecto negativo en am-bas para la condición experimental de alta gluco-sa, más marcado en la cepa C820 (figura 2). Estocoincide con la observación de que el decrementoen el porcentaje de floculación fue más acentua-do en esta cepa (tabla I). Respecto a la edadgeneracional para el gen Lg-FLO1, claramente fuemás sensible la cepa C790, disminuyendo la ex-presión significativamente. Es interesante notarque el valor de Cp fue menor en la cepa C820para la condición experimental de edadgeneracional, indicando un nivel mayor de trans-cripción respecto al estado basal, lo que concuer-da completamente con lo observado a nivelfenotípico, donde esta cepa mostró un dramáticoincremento mayor a 100% de su capacidad defloculación al alcanzar mayor edad generacional.El aumento en floculación en la cepa C790, aun-que también fue observada, sólo fue del rango de

Fig. 2. Crossing points (Cp) del gen Lg-FLO1 bajo condicio-

nes de estrés fisiológico. Los asteriscos indican diferencias

significativa (p< 0.05) entre el estado basal y de estrés.

Fig. 3. Crossing points (Cp) del gen FLO8 bajo condiciones

de estrés fisiológico. Los asteriscos indican diferencia signifi-

cativa (p< 0.05) entre el estado basal y de estrés.



23% y en esta última el Cp de Lg-FLO1 no mos-tró incremento de transcripción. Como se men-cionó previamente, esta condición experimentalafectó negativamente la expresión génica de mar-cadores fisiológicos como b-actina y ADH1, porlo que es factible que el efecto observado no fueraespecífico para los genes de floculación.

Al observar los resultados para la expresión deFLO8 (figura 3), es notable que en todos los casoslos niveles de transcripción fueran similares, esdecir, no hubo cambios con respecto al tratamien-to ni entre cepas, además fueron los niveles másbajos de expresión de los tres genes estudiados.Esto pudiera ser por varias razones: por un ladoestá el hecho de que este gen expresa un activadortranscripcional18 que probablemente requiera ni-veles más bajos de transcripción. Otra posibilidades que el transcrito tuviera un tiempo de vida cor-to. Por supuesto, la tercera posibilidad es que estegen no tenga un rol importante en la regulaciónde la transcripción en cepas industriales.

Se conoce muy bien el papel en la floculacióndel gen FLO11 en muchas cepas de laboratorio,8,30

sin embargo, en las cepas industriales analizadasaquí, hubo un efecto negativo en la expresión delFLO11 no sólo para la condición de restricción

catabólica, como era de esperarse, sino tambiénen la condición de edad generacional (figura 4),resultando más afectada la cepa C820, que para-dójicamente mostró un aumentó en su capacidadde floculación mayor a 100%. Esto indica que enlas cepas industriales evaluadas, la expresión deeste gen no estuvo correlacionada con el desplie-gue de la floculación. Evidentemente la presenciay expresión del gen Lg-FLO1 estuvo asociada conla floculación en las cepas lager estudiadas, ya quela modulación de su expresión, determinada porqPCR, concordó con los datos observados a ni-vel fenotípico. La expresión de FLO8 y FLO11 nopudo ser relacionada con el despliegue de lafloculación en las cepas estudiadas, por lo que laprevalencia de estos genes en cepas floculantes yno floculantes apunta a otras posibles funciones.

Análisis de la expresión global: en primer instan-cia, de un total de 6480 genes analizados, se ob-servó una expresión significativamente modifica-da (Z < -2 ó Z > +2) por las condiciones ensayadas,de 2031 ORF. De éstos, 1434 fueron ORF norepetidos. Esto representa 25.6% del genoma de

S. cerevisiae. De este porcentaje un 5.4% (302 ge-nes) fue específicamente modificada su expresiónparalelamente con la represión de la floculación.

Tabla I. Incidencia de genes FLO en cepas de levadura industriales y silvestres.

Notas:

+a, presencia de fragmento amplificado con el tamaño esperado.

-b, ausencia del fragmento amplificado.

Dc, amplificación débil del fragmento.

NAd, No aplica.



De los 302 genes, 147 fueron inducidos y 155reprimidos. Dentro de los procesos cuyos genes(tabla II) sufrieron inducción, destacan de manerasignificativa los relacionados al ciclo celular (oncegenes), silenciamiento de genes (8), estrés osmóti-co (7), biosíntesis de pared celular (5) y manteni-miento de telómeros (4). En particular, los genesde silenciamiento son de gran interés, ya que delos 8 que aumentaron su expresión, 7 (ESC1,

ESC4, HTZ1, HHT2, HHF1, HHF2 y TAP60) par-ticipan en el silenciamiento de genessubteloméricos, por modificación de la arquitec-tura de cromatina.31,32 Las proteínas de estosgenes interactúan con Sir4p, el cual a su vez esactivado por Cdc28p, la principal cinasa reguladoradel ciclo celular.33 Aunque ambos genes no resul-taron significativamente sobreexpresados, sus va-lores Z fueron positivos y mayores a 1. Es intere-sante notar que Cdc28p es activada por ciclinas,34

y dos de estos genes (CLB1 y CLB2) fueron activa-dos también bajo estas circunstancias. Las ciclinasson a su vez activadas por la acción de BCK2, quientambién fue sobreexpresado bajo estas condicio-nes. Es interesante notar que BCK2 ha sido im-plicado en la respuesta a estrés osmótico, por loque su activación pudiera disparar el inicio delciclo celular en presencia de altas concentracionesde azúcares fermentables.34 Adicionalmente,

CDC28 es regulado negativamente por SWE1,35

este gen resultó reprimido en los ensayos. Comoresultante de estas acciones concertadas, un im-portante número de genes del ciclo celular tam-bién resultaron sobreexpresados.

La importancia de la sobreexpresión de genessilenciadores de zonas subteloméricas radica enque es ahí donde precisamente se localiza la mayo-ría de los genes de floculación, con excepción deFLO8 y FLO11.29 Como se mencionó anterior-mente, la expresión de Lg-FLO1, determinada porqPCR, estuvo fuertemente relacionada con lamodulación de la floculación en las cepas indus-triales, mientras que FLO8 y FLO11 no sufrieronalteración en su expresión en relación a la capaci-dad de flocular. Lg-FLO1 reside en el locus que enlas cepas de laboratorio corresponde a FLO5

(YHR211W) en posición subtelomérica en elcromosoma VIII,36 por lo que una regulación porsilenciamiento de genes subteloméricos pudieraser el mecanismo modulador de su expresión. Eneste sentido, en los ensayos de microarreglos, ochogenes subteloméricos (MAL32, AAD14, FET4,YAR061W, YAR069C, YLR462W, YDR537C yYHR213W) fueron regulados negativamente, ade-más de MATa, gen que aunque no esta localizadoen regiones cercanas a telómeros, se sabe que esregulado por el mismo mecanismo desilenciamiento.32 De esta forma los resultados su-gieren evidentemente que Lg-FLO1 es regulado poreste mecanismo. La localización subtelomérica deestos genes de floculación hacía sospechar la par-ticipación de un mecanismo relacionado; ésta esla primera ocasión en que experimentalmente seobserva una clara asociación entre ambos gruposde genes.

Otros dos grupos interesantes de genes que fue-ron activados son los asociados a estrés osmóticoy biosíntesis de pared (tabla II). Ambos gruposestán relacionados, ya que la detección de condi-ciones hipo o hiperosmóticas conduce, entre otrascosas, a la modificación de la pared celular.37 Eneste caso, cinco genes de biosíntesis de pared fue-ron sobreexpresados y sólo uno reprimido, indi-

Fig. 4. Crossing points (Cp) del gen FLO11 bajo condiciones

de estrés fisiológico. Los asteriscos indican diferencia signifi-

cativa (p< 0.05) entre el estado basal y de estrés.



cando actividad en este rubro. Por otra parte, laactividad de los genes de estrés osmótico fue varia-da: siete genes fueron inducidos (SLG1, RGD2,

MSN1, HOR2, RHR2, PTC2 y BCK2), mientrasque tres fueron reprimidos (PKC1, STE20 ySNF12). Es interesante notar que Msn1p ha sidoreferido como un activador transcripcional deFLO1138 y su actividad es necesaria para la expre-sión de la floculación en cepas de laboratorio; sinembargo, en el caso de las levaduras lager, la activi-dad de este gen no tuvo efecto positivo en lafloculación, reforzando la idea de que existe unmecanismo diferente para el control de la expre-

sión de Lg-FLO1. La vía PKC1/MAPK ha sidoampliamente referida como responsable de la re-gulación de la floculación en cepas de laborato-rio. Los resultados contrastan notoriamente conesta observación en dos sentidos: 1) el principalefector transcripcional positivo de esta cascada,MSN1, estaba siendo sobreexpresado durante lafase en que la floculación estuvo reprimida, mien-tras que importantes activadores de la vía comoSTE20 y PKC139,40 se encontraron reprimidos; 2)a diferencia de los demás genes, FLO, FLO11 fueactivado en la cepa panadera, independientemen-te de su incapacidad de floculación, lo que confir-

Tabla II. Genes regulatorios asociados a la expresión de la floculación.



ma que en la cepas Saccharomyces cerevisiae var. cere-visiae (cepas de laboratorio, de panadería, ale, etc.),el gen FLO11 es activado en condiciones dondeMSN1 es activo,41 pero esto es independiente delstatus de floculación. FLO11 ha sido reportadoparticipando en muchas otras actividades,42 peroaparentemente en las cepas lager industriales supapel en la floculación es secundario. El hecho deque la supresión de la floculación no depende enprimera instancia de la activación de la vía PKC1/MAPK, queda corroborado por el hecho de queno se observó diferencia en la floculación al fer-mentar mostos de 12°P y 17°P en las cepas indus-triales (tabla I). Sin embargo, dada la alta activi-dad de expresión de estos genes en losmicroarreglos, cabe la posibilidad de que la leva-dura coordine de alguna otra forma su expresiónde floculación con la respuesta a estrés osmótico.Las claves parecen ser PTC2 y BCK2. Es impor-tante mencionar que la inducción de PTC2 fuedetectada al 5° día de fermentación, mientras queBCK2 al 3er día (datos no mostrados); la primera

codifica para una enzima cinasa serina/treonina, ytiene una amplio espectro de acción regulandonegativamente la acción de Hog1p, efector positi-vo de la expresión de los genes de respuesta a es-trés y Cdc28p, el principal regulador del ciclo ce-lular.43 BCK2 ya se mencionó anteriormente comoun activador de la expresión de CLB1 y CLB2

(ciclinas B). Ptc2p y Bck2p responden a condicio-nes antagónicas de hiperosmolaridad. Mientras queBCK2 es inducido por la detección de altos nive-les de osmolaridad, la inducción de PTC2 ocurreal momento de recibir la señal de disminución deestrés osmótico, por lo que su expresión es el pasoinicial para la eliminación de la activación deCdc28p sobre el sistema de silenciamiento de ge-nes subteloméricos. Su sobreexpresión en los en-sayos realizados podría indicar que la levadura yano detecta condiciones de hiperosmolaridad enel entorno (lo que también implica disminuciónde nutrientes), y por lo tanto debe iniciar su pro-ceso de floculación.

Fig. 5. Modelo del mecanismo de regulación de los genes de floculación en cepas industriales. El color verde en el nombre de los

genes significa inducción, el rojo represión, en menor tamaño se presentan genes cuya expresión fue aumentada, pero el Z score

fue menor a 2 (el número entre paréntesis indica el valor específico). El color de las flechas indica el efecto del producto del gen:

verde activación, rojo inactivación.



Tomando juntas todas las piezas de informa-ción obtenidas experimentalmente en los ensayosde microarreglos y qPCR, surge una imagen (figu-ra 5) que lleva a un modelo coherente y altamentesignificativo de regulación de la floculación en cepaslager. La interpretación es la siguiente: al inicio dela fermentación, la alta presencia de nutrientesdispara la expresión de los genes que activan elciclo celular, así como la respuesta a estrés osmó-tico, con la consecuente remodelación de la pa-red celular. BCK2 es inducido respondiendo a lasituación de hiperosmolaridad y activa labiosíntesis de ciclinas B. Éstas interactúan conCdc28p, que a su vez activa la cascada desilenciamiento de genes subteloméricos, a los quepertenecen, entre otros, los genes de floculación,particularmente Lg-FLO1, el principal gen estruc-tural de floculación en levaduras lager. Conformeavanza el consumo de nutrientes, el estrés osmóti-co es aliviado. En este momento, PTC2 es induci-do y su actividad reprime la respuesta a estrés os-mótico y el ciclo celular. Como consecuencia desu efecto regulador negativo sobre Cdc28p, la ac-tividad de silenciamiento de genes subteloméricosse ve relevada, por lo que la expresión de Lg-FLO1

puede ser activada.A nuestro conocimiento, éste es el primer tra-

bajo que explora los aspectos reguladores de lafloculación en cepas industriales y que reporta unaclara relación entre ciclo celular, estrés osmótico,silenciamiento de genes y floculación. A nivel prác-tico, estos resultados proveen herramientas paraentender el control del proceso de floculación ypermiten discernir cuáles condiciones de fermen-tación tienen un impacto sobre la floculación encepas industriales.

Conclusiones

La distribución de genes FLO entre cepas diferen-tes de levaduras fue heterogénea, siendo más pre-dominantes FLO8 y FLO11, además de Lg-FLO1

en levaduras lager industriales.

A nivel fenotípico, sólo la edad generacional yel perfil de carbohidratos tuvieron impacto signi-ficativo en la capacidad de floculación de las leva-duras. El perfil de carbohidratos disminuyó la ca-pacidad f loculante mientras que la edadgeneracional la aumentó.

Sólo la expresión de Lg-FLO1 se correlacionócon los cambios de floculación observados a ni-vel fenotípico en cepas industriales.

La represión de la floculación se correlacionócon diversos genes asociados a ciclo celular,silenciamiento de genes subteloméricos y estrésosmótico, lo que indica un mecanismo de con-trol de la floculación concertado con otros even-tos fisiológicos durante la fermentación.

Resumen

La floculación es una característica muy impor-tante de las cepas industriales de Saccharomyces ce-

revisiae, que facilita las operaciones de clarificacióndel producto y recuperación de levadura. Sin em-bargo se desconocen los genes que controlan lafloculación bajo condiciones de operación indus-trial. En el presente trabajo se determinó el nú-mero y tipo de genes relacionados con lafloculación (FLO) por la reacción en cadena de lapolimerasa (PCR) de punto final, así como susniveles de expresión en diferentes cepas de levadu-ras industriales, mediante PCR cuantitativa(qPCR), bajo condiciones de proceso que afectanla floculación (alta presión osmótica, presiónhidrostática, represión catabólica, restricción ca-lórica y edad generacional). Por otra parte se anali-zó la expresión global a nivel transcripcional pormicroarreglos de ADN. La capacidad floculantefue disminuida de forma específica por alto con-tenido de glucosa en el medio (represióncatabólica); pero incrementada con la edadgeneracional. El contenido de genes FLO fue va-riable (de 3 a 6 genes por cepa), siendo más con-servados los genes Lg-FLO1, FLO8 y FLO11. Enlos resultados de qPCR se determinó que sólo laexpresión de Lg-FLO1 se correlacionó con la



f loculación. Finalmente, el análisis demicroarreglos reveló que la regulación defloculación esta sujeta principalmente a un meca-nismo de silenciamiento epigenético por modifi-cación de la arquitectura de la cromatina en genessubteloméricos.

Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae, Genes FLO,Floculación, Microarreglos de ADN, Fermenta-ción, PCR cuantitativa, Factores de estrés.

Abstract

Flocculation is a very important characteristic ofSaccharomyces cerevisiae industrial strains, whichassists product separation and yeast harvesting.However, genes controlling flocculation underindustrial operation are unknown. In this study,genes participating in flocculation (FLO) wereidentified via end point PCR, and their expres-sion was studied by quantitative PCR (qPCR)under conditions that impact flocculation (os-motic and hydrostatic pressure, catabolic repres-sion, caloric restriction and generational aging).Also, global expression analysis under these fer-mentation conditions was carried out by DNAmicroarray. Results showed that flocculation wasdiminished by catabolic repression; but it was in-creased by generational aging. The content of FLO

genes was variable (3 to 6 genes by strain) beingLg-FLO1, FLO8, and FLO11 the most conserved.In qPCR experiments, results showed that onlythe expression of Lg-FLO1 was correlated with floc-culation. Finally, DNA microarray analysis revealedthat the genes related to regulation of floccula-tion were mainly those that participate insubtelomeric gene silencing via chromatin archi-tecture remodeling.

Keywords: Saccharomyces cerevisiae, FLO genes, Floc-culation, DNA microarrays, Fermentation, Quan-titative PCR , Stress factors.

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Recibido: 16 de agosto de 2009

Aceptado: 10 de septiembre de 2009


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